一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù) 后的生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌是一種原發(fā)于大腸的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌。結(jié)直腸癌因其發(fā) 部位不同而表現(xiàn)出不同的臨床癥狀及體征，主要有腹痛、便血、腹部包塊、腸梗阻等，伴或不 伴貧血、發(fā)熱和消瘦等全身癥狀。在我國(guó)，結(jié)直腸癌作為第=大腫瘤，其發(fā)病率及死亡率近 年來(lái)逐年上升。由于診斷技術(shù)的不斷提高，使新發(fā)結(jié)直腸癌病例中非轉(zhuǎn)移性疾病的比例大 大增加，對(duì)于該部分患者，外科手術(shù)及輔助化療是主要治療手段。但是目前尚缺乏有效的預(yù) 后判斷及化療療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前臨床上主要依據(jù)基于臨床病理指標(biāo)（如腫瘤大小、淋己 結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織分級(jí)等）的?m分期作為疾病預(yù)后的判斷及指導(dǎo)臨床治療，但 根據(jù)此分期判斷患者預(yù)后存在較大的異質(zhì)性，亦不能預(yù)測(cè)腫瘤患者對(duì)化療的反應(yīng)。
[0003] 研究表明II、111期結(jié)直腸癌患者經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后仍有20% -30%出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中 40 -50 %復(fù)發(fā)發(fā)生在原發(fā)灶切除后一年內(nèi)，80 %復(fù)發(fā)發(fā)生在原發(fā)灶切除=年內(nèi)，復(fù)發(fā)后5年 生存率低于1%。約有50%結(jié)直腸癌患者最終會(huì)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性疾病而死亡。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸 癌患者僅有極少數(shù)可W經(jīng)手術(shù)及化療而得到治愈，全身化療是該類患者的主要治療方法， W氣尿喀晚藥物為基礎(chǔ)聯(lián)合奧沙利銷或者伊立替康方案已成為晚期結(jié)直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療 方案。此外，近年來(lái)抗血管生成藥物（貝伐珠單抗）或表皮生長(zhǎng)因子單抗（西妥昔單抗或 帕巧單抗）聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療使有效率進(jìn)一步提高，但有相當(dāng)一部分病人在治療時(shí)出現(xiàn)化療藥 物耐藥甚至開始即出現(xiàn)不敏感最終因疾病進(jìn)展而死亡。因此，篩選出對(duì)化療敏感的人群在 臨床實(shí)踐中顯得尤為重要，可使化療無(wú)效人群避免不必要的毒副作用及承擔(dān)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù) 擔(dān)，但至今尚沒有有效的手段用于化療藥物敏感人群的選擇，尋求有效的標(biāo)志物用于化療 敏感性指標(biāo)具有極大的應(yīng)用前景。
[0004] 微小核糖核酸（microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)約19至23個(gè)核巧酸的非編碼單鏈小 核糖核酸分子，其主要功能是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。miRNA通過(guò)與祀mRNA3'端非 翻譯序列完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致祀mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制從而調(diào)控祀基因的表 達(dá)。miRNA參與1/3人類蛋白編碼基因調(diào)控，它與多種生理活動(dòng)有關(guān)，如生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增 殖、細(xì)胞調(diào)亡、細(xì)胞分化等；也與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如糖尿病、屯、血管疾病、月中 瘤等。最近的研究顯示h^33，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因或癌基因樣作用。 已證實(shí)，腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中的某些miRNA表達(dá)水平發(fā)生了變化，相對(duì)于正常組織，一些 miRNA表達(dá)量顯著上升或下降。許多癌組織如肺癌、乳腺癌和食管癌等組織都有若干組織特 異性miRNA的表達(dá)，提示miRNA有腫瘤組織特異性。另外，miRNA的表達(dá)也與腫瘤分化程度 W及預(yù)后有關(guān)。最近，大量的研究結(jié)果揭示，miRNA在血清中能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，耐RNA酶的 降解，一些腫瘤包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌和膜腺癌患者血清中miRNA 表達(dá)譜與正常人有顯著差異，均有各自特異的表達(dá)譜，同時(shí)該種變化還可見于早期癌中。該 種穩(wěn)定存在于血清中的循環(huán)miRNA因其用于腫瘤等疾病的早期診斷、預(yù)后及療效判斷從而 指導(dǎo)個(gè)體化治療顯示出潛在的臨床應(yīng)用前景。
[0005]目前尚沒有利用無(wú)創(chuàng)傷性、取材方便的血液標(biāo)本檢測(cè)與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效 及預(yù)后生物標(biāo)志物相關(guān)的特異性miRNA組合及檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就在于通過(guò)對(duì)患者接受化療前的血清樣本miRNA進(jìn)行檢測(cè)和比對(duì)， 分析miRNA表達(dá)水平與化療敏感性的關(guān)系，聯(lián)系患者的生存資料及治療效果，篩選一組與 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效及預(yù)后相關(guān)的血清miRNA,并利用該些miRNA的化qMan探針制備 出適用于臨床診療用途的試劑盒，為預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者化療敏感性提供特異性的W 及迅速的無(wú)創(chuàng)傷性檢測(cè)手段。
[0007]W下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步描述：
[0008] -種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的miRNA組合，其包括下列 miRNA;miR- 13化及miR- 208b。
[0009] 上述miRNA組合的篩選方法包括W下步驟（見圖1):
[0010] (1)分別收集12例對(duì)奧沙利銷（F0LF0幻敏感和不敏感患者化療前混合血清樣本， 提取總RNA;
[0011] (2)采用高靈敏度、高精確性和高重復(fù)性的低密度巧片技術(shù)（TaqManlowdensity Arraytechnology)進(jìn)行miRNAs檢測(cè)，篩選在化療敏感組（PR+SD)及不敏感組（PD)間穩(wěn)定 差異表達(dá)的一組miRNA;
[0012] (3)用實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法（TaqMan探針法）對(duì)一組標(biāo)本進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，從低密 度巧片方法初篩出的miRNA中復(fù)篩出表達(dá)差異顯著miRNA;
[0013] (4)進(jìn)一步用定量PCR方法對(duì)大批量標(biāo)本進(jìn)行逐個(gè)驗(yàn)證，篩選出穩(wěn)定的表達(dá)差異 顯著的一組miRNA。
[0014] 具體來(lái)說(shuō)，上述篩選方法包括W下步驟；（1)收集接受奧沙利銷（F0LF0幻患者化 療前混合血清或血漿樣本，提取總RNA;(2)運(yùn)用低密度巧片技術(shù)對(duì)上述RNA進(jìn)行檢測(cè)，初篩 出在化療敏感組（PR+SD)及不敏感組（PD)間穩(wěn)定差異表達(dá)的一組miRNA;(3)將抽提的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用巧光定量PCR訂aqMan探針法）對(duì)初篩出的miRNA進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證，挑 選出穩(wěn)定、特異表達(dá)的一組miRNA。
[001引本發(fā)明使用的檢測(cè)方法可W選自；RT-PCR方法、低密度巧片技術(shù)（TaqManlow densityArraytechnology)、Real-timePCR方法中的一種或幾種。例如，血清中miRNA 分子的檢測(cè)方法包括W下步驟：
[0016] (1)使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取血清總RNA;
[0017] (2)通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;
[001引 （3)利用化qMan探針法進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0019] (4)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
[0020] (5化B染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的miRNA 化qMan探針組合物，包括miR- 13化和miR- 208b的化qMan探針。
[0022] 上述化qMan探針組合物優(yōu)選包括W下序列所示的化qMan探針中的一種或多種：
[0023]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的miRNA組合，其特征在于該 miRNA組合包括下列miRNA:miR- 135b和miR- 208b。
2. -種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的miRNATaqMan探針組合物，其 特征在于該TaqMan探針組合物包括權(quán)利要求1所述miRNA的TaqMan探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的TaqMan探針組合物，其特征在于所述miRNA的TaqMan探針 序列為：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2。
4. 權(quán)利要求1所述的miRNA組合在制備檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的試 劑或工具中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的miRNA組合在制備預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者化療敏感性的試劑或 工具中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2或3所述的TaqMan探針組合物在制備檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和 /或預(yù)后的試劑或工具中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求2或3所述的TaqMan探針組合物在制備預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者化療敏 感性的試劑或工具中的應(yīng)用。
8. -種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的試劑盒，其特征在于該試劑盒 包含權(quán)利要求2或3所述的TaqMan探針組合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還可以包括Taq酶、dNTP、氯 化鎂和不含Mg2+的10XPCR緩沖液PCR緩沖液。
10. -種用于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者化療敏感性的試劑盒，其特征在于該試劑盒包 含權(quán)利要求2或3所述的TaqMan探針組合物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效和/或預(yù)后的生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用。所述miRNA組合包括：miR-135b、miR-208b。所述試劑盒包括上述miRNA的TaqMan探針組合。在本發(fā)明中，血清較易獲得，無(wú)需其它組織，屬于無(wú)創(chuàng)性檢查；血清miRNA反映的是機(jī)體整體的病理、生理情況，以其作為化療療效和預(yù)后標(biāo)志物可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；所述試劑盒簡(jiǎn)化了TaqMan探針庫(kù)，減少制作成本和生產(chǎn)時(shí)間，增加了針對(duì)性和實(shí)用性，提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性；所述組合、方法、試劑盒不僅能夠用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療療效判斷，還能用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療的預(yù)后判斷。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104774916
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410794712
【發(fā)明人】張辰宇, 巴一, 曾科, 李佳璐, 陳熹
【申請(qǐng)人】南京大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日