生化細(xì)胞獲得生物活性物質(zhì)組合物的方 法。
[0022] 包含在永生化細(xì)胞獲得的生物活性物質(zhì)組合物中的生物活性物質(zhì)主要包括：堿 性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)，胰島素樣生長因子-1、2(IGF-1、2)，角化細(xì)胞生長因子 (KGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，人類轉(zhuǎn)化生長因子-a、0 (TGF-a、0)，血管內(nèi)皮生 長因子（VEGF)，表皮生長因子（EGF)以及神經(jīng)生長因子（NGF)等。
[0023] 鑒于包含的生物活性物質(zhì)較多，本發(fā)明中主要關(guān)注的細(xì)胞因子有：細(xì)胞表皮生長 因子（Epidermal Growth Factor，EGF)、喊性成纖維生長因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(Tansformating Growth Factor-0 , TGF-0)。EGF 是 人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性物質(zhì)，由53個氨基酸組成的單鏈多肽，含有三對二硫鍵，分子量為 6KD，極微量就能明顯促進表皮細(xì)胞的增殖。EGF是研究最多，使用最為廣泛的細(xì)胞生長因 子。研究發(fā)現(xiàn)，使用EGF能夠增加其他內(nèi)源性生長因子的含量，促進羥脯氨酸合成，促使細(xì) 胞分泌透明質(zhì)酸和糖蛋白，調(diào)節(jié)膠原酶和膠原的合成、分泌和沉淀，調(diào)節(jié)膠原降解，使膠原 纖維以線性方式排列，合理調(diào)整皮膚結(jié)構(gòu)，增強創(chuàng)面抗張程度，延緩皮膚衰老，減少皺紋，提 高愈合質(zhì)量并具有增白等作用。目前，EGF已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容等領(lǐng)域，主要用于治 療燒燙傷、促進傷口愈合、修復(fù)疤痕，修復(fù)胃腸道黏膜以及眼角膜的損傷等。bFGF是人體內(nèi) 產(chǎn)生的另一種活性物質(zhì)，多分離自神經(jīng)-組織，腦垂體，腎上腺皮質(zhì)和胎盤。人的bFGF具有 18-24kDa的大小，能夠促進皮膚組織、角膜和氣管上皮組織的增殖分化，具有調(diào)整皮膚結(jié) 構(gòu)，增強創(chuàng)面抗張程度，延緩皮膚衰老，減少皺紋，減少疤痕形成等作用。TGF是刺激成纖維 細(xì)胞轉(zhuǎn)化以分化為腫瘤樣表型的因子，由兩種蛋白TGF-a和0的混合物組成，并發(fā)現(xiàn)與腫 瘤抑制因子而不是腫瘤刺激因子在一起。其中，人類TGF-0 1具有25kDa的分子量。TGF-3 1 通常調(diào)控細(xì)胞的增殖諸如抑制因子，通過重復(fù)蛋白降解的抑制和蛋白的合成從而促進細(xì)胞 膜的沉淀之外，還可以促進蛋白水解產(chǎn)物的沉積，并且通過各種機制刺激免疫抑制反應(yīng)。
[0024] 本發(fā)明提供了通過永生化細(xì)胞獲得生物活性物質(zhì)組合物的方法，其制作過程包括 以下步驟：
[0025] 1，制作永生化細(xì)胞，通過抽取靜脈血或者通過手術(shù)后的身體組織分離體細(xì)胞，采 用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染方法制作永生化細(xì)胞，優(yōu)選的是采用靜脈采血法分離淋巴細(xì)胞通過EBV轉(zhuǎn)染 生產(chǎn)永生化細(xì)胞；
[0026] 2,在無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)所述永生化細(xì)胞；
[0027] 3,通過中空纖維超濾系統(tǒng)分離純化生物活性物質(zhì)；
[0028] 4,對上述分離純化的生物活性物質(zhì)進行檢測。
[0029] 具體來說：
[0030] 1,制作永生化細(xì)胞
[0031] 在本發(fā)明中，通過抽取靜脈血或者通過手術(shù)后的身體組織分離體細(xì)胞，采用相應(yīng) 的轉(zhuǎn)染方法制作永生化細(xì)胞，優(yōu)選的是采用靜脈采血法分離淋巴細(xì)胞通過EBV轉(zhuǎn)染生產(chǎn)永 生化細(xì)胞。具體而言，包括如下幾個步驟：
[0032] (1)體細(xì)胞的獲得：可以通過多種途徑獲得人體組織的方法來獲得體細(xì)胞。如血 液中的淋巴細(xì)胞，以及在常見手術(shù)過程中能夠獲得的乳腺、脂肪、皮膚、眼皮、口腔黏膜，包 皮等。優(yōu)選的是最容易獲得的血液淋巴細(xì)胞。
[0033] 從血液最容易獲得體細(xì)胞。抽血是常規(guī)檢測中幾乎傷害最小的，相比其它獲得體 細(xì)胞的方式而言，抽血不需要進行創(chuàng)傷性外科手術(shù)，不需要專業(yè)技術(shù)人員和設(shè)備，給個體造 成的傷害最小。此外，抽血相對來說費用低廉，操作簡單，技術(shù)成熟，所需材料簡單易得。通 過血液獲得淋巴細(xì)胞是最佳的獲得體細(xì)胞的方式。采集過程由具有從業(yè)資質(zhì)的醫(yī)護人員采 集個體的5-10ml靜脈血入肝素抗凝采血管中。室溫下48h內(nèi)運送至實驗室準(zhǔn)備進行下一 步操作。
[0034] (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：可以通過多種途徑進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如腫瘤病毒包括EB病毒、腺病 毒、猴腎細(xì)胞病毒、多瘤病毒等。此外，目前常用還有構(gòu)建含端粒酶催化亞基（hT ERT)的質(zhì) 粒進行轉(zhuǎn)染。
[0035] 本發(fā)明中優(yōu)先采用能夠轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞的EB病毒進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，具體來說包 括：將抗凝管中保存的靜脈血混合均勻后在超凈臺中轉(zhuǎn)移上述血液到15ml-25ml試管中， 加入2-4ml RPMI1640進行稀釋，混合均勻。取裝有淋巴細(xì)胞分離液的試管，將上述稀釋過 的全血加入試管內(nèi)，無色透明的液層為含有淋巴細(xì)胞的分離液。將上述含分離液的試管進 行2500-3000rpm水平式離心20-30分鐘。離心后可見四層，第三層含有白色絮狀物質(zhì)的 即為淋巴細(xì)胞層。取另一試管，加入10ml-20ml RPMI1640,將淋巴細(xì)胞層液體輕輕吸取加 入管中，輕搖后1000_1500rpm水平式離心5-10分鐘。棄去上清，再用RPMI1640重復(fù)洗滌 兩到三次。將上述淋巴懸液中加入2ml-4ml的0. 5% PHA全培養(yǎng)液，1. 2ml-2. 4ml的EBV， 0. 4ml-0. 8ml的環(huán)孢霉素A，混合均勻。分裝入2-4個10ml培養(yǎng)瓶中。放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱 中37°C，5-10% C02培養(yǎng)3-4天。第二天觀察淋巴細(xì)胞有增大或淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凝集即表明 轉(zhuǎn)化成功。此外，注意培養(yǎng)液的顏色變化，一般隨著細(xì)胞生長，培養(yǎng)液會從橙紅色變?yōu)槌赛S 色，如果2-3天后，顏色沒有變化可懷疑細(xì)胞生長存在問題。從第四天開始補加3ml培養(yǎng)基， 如有需要可以分瓶培養(yǎng)或者半量換液。三天后開始采用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，如發(fā) 現(xiàn)B細(xì)胞體積增大，迅速分裂成團，茂密生長，出現(xiàn)增生集落；建立的細(xì)胞系可傳代，能夠連 續(xù)培養(yǎng)，表明B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功。
[0036] 2,在無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)所述永生化細(xì)胞
[0037] 在本發(fā)明中，為了獲得較多數(shù)量的生物活性物質(zhì)，需要對上述永生化細(xì)胞進行擴 大培養(yǎng)。應(yīng)用于人體的細(xì)胞培養(yǎng)過程具有較高的培養(yǎng)要求，一般采用明確成分的無血清 培養(yǎng)基。本發(fā)明中優(yōu)先的采用市售的針對無血清培養(yǎng)基。當(dāng)上述永生化細(xì)胞數(shù)量達到 3-6 X 10 A 6/ml時，600-1500rpm離心5-10min，PBS緩沖液洗滌三次，加入市售無血清培養(yǎng) 基，可以根據(jù)需要換入較大的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。
[0038] 在本發(fā)明中，為了獲得更多的生物活性物質(zhì)，需要在每個培養(yǎng)孔中加入1粒玻 璃珠；重組人EFG10-100ng ;硫辛酸2-4uM;L-抗壞血酸10-lOOuM;膽鈣化固醇（維生素 D3) 5-10uM。輕微震動8h，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C，5-10% C02共培養(yǎng)24-48h后，傳代2-3 次。
[0039] 3,通過中空纖維超濾系統(tǒng)分離純化生物活性物質(zhì)
[0040] 具體而言，在本發(fā)明中，可以將上述生物活性物質(zhì)進行提純。將上述培養(yǎng)液液 經(jīng)5000-6000rmp離心20-30min進行固液分離，取上清液，對上清液先用截留分子量為 100-120KD的中空纖維超濾系統(tǒng)進行超濾，收集過濾液，再用截留分子量為30-50KD中空纖 維超濾系統(tǒng)進行超濾，收集濃縮的濾過液。經(jīng)過上述過程能夠去除培養(yǎng)基中大部分雜物質(zhì)， 獲得較為純凈的永生細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)，然后可以根據(jù)需要將濃縮液直接進行下一 步生產(chǎn)工藝，或者將此濃縮液進行真空冷凍干燥，制備成細(xì)胞生物活性物質(zhì)濃縮液粉末。
[0041] 4,生物活性物質(zhì)進行檢測
[0042] 在本發(fā)明中，需要對永生細(xì)胞獲得的生物活性物質(zhì)進行檢測，具體而言，包括如下 幾個步驟：
[0043] (1)細(xì)胞生長因子的檢測：
[0044] 在本發(fā)明中，為了檢測培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子，酶聯(lián)免疫法，將培養(yǎng)基 1000-2000rpm，離心5-10分鐘后通過0? 22um過濾器進行除菌并去除細(xì)胞殘存物質(zhì)。將上 述培養(yǎng)液稀釋十倍，避免非特異性干擾。用ELISA試劑盒測量所述培養(yǎng)基中分泌的每種生 長因子的濃度。優(yōu)選的檢測EGF、bFGF和TGF-P1這三種細(xì)胞因子的含量。本發(fā)明中采用 美國R&DSystems公司生產(chǎn)的Quantikine系列人生長因子ELISA試劑盒對上述三種細(xì)胞因 子進行檢測。檢測方法依據(jù)試劑盒所配的試劑盒說明書。分別將擴大培養(yǎng)后6h、12h、18h、 24h和48h的培養(yǎng)基，進行稀釋后加入包被好抗體的微孔板中，依次加入待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品 等，經(jīng)過溫育并徹底洗滌后經(jīng)過顯色后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（0D值），計算 樣品濃度。測試結(jié)果顯示不同時間，各種生長因子的濃度有差異，隨著培養(yǎng)時間的增加，生 長因子的濃度隨之升高。每個樣本設(shè)置有三個重復(fù)。
[0045] (2)端粒酶活性的檢測
[0046] 永生化細(xì)胞除了能在體外長期傳代外，還具有很高的端粒酶活性。一般采用用端 粒酶重復(fù)擴增PCR(TRAP-PCR)來檢測永生化細(xì)胞的端粒酶活性。1994年Kim建立了基于 PCR 基礎(chǔ)上的端粒重復(fù)序列擴增法（telomeric repeat amplification protocol，TRAP)。 端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿 基的重復(fù)序列，用聚丙烯酰胺（PAGE)凝膠電泳可顯示6個堿基差異的梯