一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)進(jìn)行菌樣的快速檢測(cè)的方法，具體 是一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)試劑盒。
[0002]
【背景技術(shù)】： 創(chuàng)傷弧菌（Vibrio Vulnificus)是一種廣泛分布于亞熱帶淺海水域及海產(chǎn)品如貝類(lèi)、 蝦、蟹等，氣候溫暖的六月至十月，海中此類(lèi)淡菌濃度高。創(chuàng)傷弧菌是革蘭氏陰性菌，具移動(dòng) 性、彎曲的桿菌，單獨(dú)存在或尾端連揚(yáng)戊"C"或者"S〃型。對(duì)酸吐敏感，pH6以下就不生長(zhǎng)。 目前已發(fā)現(xiàn)100多種，其中至少4種會(huì)致病。創(chuàng)傷弧菌的感染造成臨床上的病癥有兩種： 1、原發(fā)吐敗血癥（primary septicemia)此由腸胃感染引起的，是由于吃入生的或未煮熟的 魚(yú)蝦類(lèi)或生蠔，病人會(huì)有發(fā)熱、惡心、嘔吐、皮膚病變、壞死勝潰爛及敗曲一癥休克等癥狀。 創(chuàng)傷弧菌可放出強(qiáng)烈毒素進(jìn)入血液，將引起敗血病及體克，誘發(fā)全身器官衰竭導(dǎo)致死亡，死 亡率高達(dá)50%以上，如果因而休克，死亡率更是在百分之九十以上；2、傷口感染（infected wound)慢性肝炎患者或者免疫力弱的人，若皮膚有傷口又接觸到含有病菌的海水或被蝦、 蟹類(lèi)刺傷，就有可能被創(chuàng)傷弧菌感染。感染該菌種的初期，在感染部位有腫脹、紅斑、進(jìn)而形 成水泡，之后傷口潰爛蔓延，創(chuàng)傷弧菌會(huì)入侵筋膜和肌肉的間隙，出現(xiàn)組織壞死或嚴(yán)重的蜂 窩性組織炎，然后病菌沿著間隙直上繼續(xù)感染。創(chuàng)傷弧菌感染病情發(fā)展快速，通常腳趾頭蔓 延到大腿只需一到兩天時(shí)間。有時(shí)候甚至需要截肢來(lái)阻止感染蔓延，如果不幸很可能引發(fā) 次發(fā)性敗血癥造成死亡，死亡率約為24%。
[0003] 在LAMP反應(yīng)中，不需要通過(guò)熱變性將雙鏈DNA變成單鏈，因?yàn)殡p鏈DNA在65°C左 右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任伺一條引物與雙鏈DNA的互補(bǔ)鏈部位進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)延伸時(shí)， 另一條鏈就會(huì)脫落成為單鏈。
[0004] LAMP的原理：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是2000年由日本Notomi T等人研發(fā)的核酸擴(kuò) 增方法，其原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase )，在恒溫條件（65°C左右）保溫約lh，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò) 增出LAMP特征性梯狀條帶，并可通過(guò)設(shè)計(jì)兩條環(huán)引物使反應(yīng)速度提升1/2~1/3。在DNA延 伸合成時(shí)，從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)（dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié) 合，產(chǎn)生焦磷酸鎂衍生物，呈現(xiàn)白色沉淀，只需肉眼觀察即能判斷擴(kuò)增與否；亦可用結(jié)合雙 鏈DNA的熒光染料SYBR GreenI染色，在紫外燈或日光照射透視下呈現(xiàn)強(qiáng)熒光。如果含有 擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。
[0005] LAMP的優(yōu)點(diǎn)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)特異性強(qiáng)：4條引物（或6 條引物）對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)的識(shí)別，受非靶序列的影響小，保證了 LAMP擴(kuò)增的高 度特異性；（2)敏感性高：檢測(cè)限更低，僅為6個(gè)拷貝，高于PCR法；（3)快速：在lh內(nèi)可將 靶序列擴(kuò)增至10 9~101CI倍，產(chǎn)率可達(dá)到0.5 m g/mL。向反應(yīng)體系中添加2條環(huán)引物（Loop Primers )，可進(jìn)一步提高LAMP反應(yīng)的速度，縮短反應(yīng)時(shí)間：（4)操作簡(jiǎn)便：不需PCR儀和特 殊試劑，只需一恒定溫度，即能擴(kuò)增目標(biāo)基因，模板也不需要熱變性。擴(kuò)增產(chǎn)物不需繁瑣的 電泳，肉眼即可判斷。加入逆轉(zhuǎn)錄酶，還可進(jìn)行RT LAMP，完成針對(duì)RNA病毒的擴(kuò)增；（5)實(shí) 時(shí)定量：可克服常規(guī)PCR只能定性檢測(cè)的不足。可見(jiàn)，LAMP有利于在一些基層機(jī)構(gòu)的應(yīng)用和 大規(guī)模樣品的檢測(cè)，為食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持，在食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)、 臨床疾病診斷及微陣列基因芯片的開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 因海洋創(chuàng)傷弧菌的危害性和快速發(fā)病的特點(diǎn)，需要快速進(jìn)行檢測(cè)。為了加快反應(yīng) 的速度，將常規(guī)的LAMP法檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行優(yōu)化，選擇了適宜的引物，通過(guò)兩種表面活性 劑的作用，增加反應(yīng)組分的有效接觸面積，加快反應(yīng)的進(jìn)行。試劑組分中加入與聚合酶等量 的水解酶（UNG酶)，可以有效將擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間控制在30分鐘，比常規(guī)檢測(cè)檢測(cè)方法用時(shí)（50 分鐘）要短，加快了臨床的檢測(cè)時(shí)間，增強(qiáng)了 LAMP法檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的應(yīng)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)試劑盒（LAMP法)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種創(chuàng)傷 弧菌快速檢測(cè)試劑盒（LAMP法)。本發(fā)明優(yōu)化了組分，通過(guò)調(diào)整表面活性劑和加入U(xiǎn)NG酶的 作用，加快了檢測(cè)的時(shí)間，增強(qiáng)了試劑的臨床檢測(cè)應(yīng)用。
[0008] 本試劑盒包括以下組分及含量的試劑： (1) 10X反應(yīng)緩沖液 2.5yL (2) dNTP Mixture 10mM each 3. 5 y L (3) 表面活性劑 甜菜喊 5mmol/L 2 y L AEO-9 5mmol/L 2 y L (4) MgS04 150mmol/L 1 y L (5) Bst 酶 16KU/mL 0. 5 y L (6) UNG 酶 16KU/mL 0. 5 y L (7) 染料 媽黃綠素4mmol/L 1 y L (8) 去離子水 4yL (9) FIP 引物 20umol/L 2 y L BIP 引物 20umol/L 2 y L F3 引物 5 umol/L 1 y L B3 引物 5 umol/L 1 y L ； (10) 陽(yáng)性對(duì)照 DNA lOumol/L; 用兩條外引物擴(kuò)增出創(chuàng)傷弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp)重組入質(zhì)粒所得。
[0009] 所述10 X反應(yīng)緩沖液包含以下含量的組分： Tris-HCl 緩沖液 PH 8.8 200mM KC1 100mM (NH4)2S04 100mM MgS04 20mM Triton X-100 1% ； 所述FIP引物的堿基序列如下： 5' AATCCGCGTCCCAGGCTTTCCTGACGCCAACGCCTTCCGTT' 3 (SEQ ID N0:1) BIP引物的喊基序列： 5' AGCGTGTCCAGTCCGTCTAGCGCCAGTGCCCACAGGTCGTG' 3 (SEQ IN NO :2) F3引物的喊基序列： 5' CAACGTCACCATGGGCGTTA ' 3 (SEQ ID NO : 3) B3引物的喊基序列： 5' GCTTTAGAAGTCTTATGACC ' 3 (SEQ ID NO : 4) 本試劑盒使用過(guò)程的主要步驟如下： 1、取各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存。
[0010] 2、預(yù)混溶液的配制(請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行） (1) 反應(yīng)按照下表比例進(jìn)行配制（1次反應(yīng)量）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的快速試劑盒，其特征在于，包括以下含量及體積的試劑： (1)IOX反應(yīng)緩沖液 2.5yL (2) dNTPMixtureIOmMeach 3. 5uL (3) 表面活性劑 甜菜喊 Smmol/],2yL AE0-9 5mmol/L 2yL (4) MgSO4 150mmol/LIyL (5) Bst酶 16KU/mL 0. 5 yL (6) UNG酶 16KU/mL 0. 5 yL (7) 1?黃綠素 4mmol/LIyL (8) 去離子水 4yL (9) FIP引物 20umol/L 2yL BIP 引物 20umol/L 2 yL F3引物 5umol/LIyL B3引物 5umol/LIyL; (10)陽(yáng)性對(duì)照DNAIOumol/L； 所述IOX反應(yīng)緩沖液包含以下含量的組分： Tris-HCl 緩沖液 PH8.8 200mM KCl IOOmM (MM)2SO4IOOmM MgSO4 20mM TritonX-100 1% ； 所述FIP引物的堿基序列如SEQIDNO: 1所示； 所述的BIP引物的堿基序列如SEQINNO:2所示； 所述的F3引物的堿基序列如SEQIDNO:3所示； 所述的B3引物的堿基序列如SEQIDNO:4所示。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)試劑，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化試劑組分，調(diào)整了表面活性劑的組分，同時(shí)加入水解酶UNG酶的方式，加快了反應(yīng)速度，在較短的時(shí)間內(nèi)，達(dá)到與常規(guī)檢測(cè)方法等效的程度，這大大縮短了臨床檢測(cè)的應(yīng)用時(shí)間，同時(shí)未影響臨床結(jié)果的判斷，能夠快速的獲得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于海洋創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-04, C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104789680
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510201466
【發(fā)明人】胡成進(jìn), 侯亞蘭, 譚柏清
【申請(qǐng)人】胡成進(jìn)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日