用于去除dna的方法
【專利說明】用于去除DNA的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種非常有效的用于從發(fā)酵液中獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中該蛋白 質(zhì)產(chǎn)物不含殘留的宿主細(xì)胞DNA。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 用于從發(fā)酵液中沉淀出雜質(zhì)的鋁化合物的用途是已知的：W0 94/01537披露了可 溶性鋁酸鹽結(jié)合通過加入一種酸的同步pH調(diào)整的用途；US3, 795, 586披露了一種兩階段 工藝，藉此通過使用絮凝劑（如鋁酸鹽）將第一非酶組分從發(fā)酵液中去除，并且然后用另一 種絮凝劑沉淀出可溶性酶產(chǎn)物；并且W0 96/38469披露了結(jié)合另一種絮凝劑、溶液的澄清 和膜濃縮的W0 94/01537的方法。
[0004] 然而，從發(fā)酵液中去除殘留的宿主細(xì)胞DNA是非常困難的，因此在本領(lǐng)域中迫切 需要開發(fā)程序來克服殘留DNA的問題。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)用聚合氯化鋁處理的發(fā)酵液不含殘留宿主細(xì)胞DNA，意 味著每克發(fā)酵液的DNA小于10ng，即低于檢測(cè)限，因此本發(fā)明要求：
[0007] -種用于從發(fā)酵液中去除殘留宿主細(xì)胞DNA的方法，該發(fā)酵液包含感興趣的蛋白 質(zhì)和產(chǎn)生該感興趣的蛋白質(zhì)的微生物，所述方法包括：
[0008] a)將聚合氯化鋁添加至該發(fā)酵液，并且
[0009]b)從該發(fā)酵液中分離絮凝的微生物。
[0010] 一種用于從發(fā)酵液中去除殘留宿主細(xì)胞DNA的方法，該發(fā)酵液包含感興趣的蛋白 質(zhì)和產(chǎn)生該感興趣的蛋白質(zhì)的微生物，所述方法包括：
[0011]a)從該發(fā)酵液中分離微生物，并且
[0012] b)將聚合氯化鋁添加至該發(fā)酵液。
[0013] 一種用于從發(fā)酵液和后續(xù)下游工藝液體中去除殘留宿主細(xì)胞DNA的方法，該發(fā)酵 液和后續(xù)下游工藝液體包含感興趣的蛋白質(zhì)和產(chǎn)生該感興趣的蛋白質(zhì)的微生物，所述方法 包括：
[0014]a)將聚合氯化鋁添加至該發(fā)酵液并且添加至該后續(xù)下游工藝液體，
[0015]b)從該發(fā)酵液中分離絮凝的微生物并且
[0016]c)在添加聚合氯化鋁之后精制該后續(xù)下游工藝液體。
【附圖說明】
[0017]圖1披露了PCR擴(kuò)增的殘留DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳，所述殘留DNA片段來自 未處理培養(yǎng)液和實(shí)例1的GC850?絮凝樣品的超濾濃縮物（UF濃縮物）。由對(duì)應(yīng)泳道中的 凝膠上的條帶（箭頭）指示殘留DNA的存在。該P(yáng)CR條帶的強(qiáng)度與樣品中存在的殘留DNA 的量直接關(guān)聯(lián)。
[0018]圖2披露了PCR擴(kuò)增的殘留DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳，所述殘留DNA片段來自 未處理培養(yǎng)液和實(shí)例1的NordPAC18?絮凝樣品的超濾濃縮物（UF濃縮物）。由對(duì)應(yīng)泳道 中的凝膠上的條帶（箭頭）指示殘留DNA的存在。
[0019]圖3披露了PCR擴(kuò)增的殘留DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳，所述殘留DNA片段來自 未處理培養(yǎng)液和實(shí)例2的NordPAC18?、GC850?和鋁酸鈉絮凝樣品的超濾濃縮物（UF濃縮 物）。由對(duì)應(yīng)泳道中的凝膠上的條帶（箭頭）指示殘留DNA的存在。
[0020] 發(fā)明的詳細(xì)說明
[0021] 本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單且非常有效的從發(fā)酵液中去除殘留宿主細(xì)胞DNA的方法。在 本發(fā)明的范圍之內(nèi)，宿主細(xì)胞DNA被定義為包括來自生產(chǎn)菌株的基因組DNA和編碼感興趣 的蛋白質(zhì)的DNA片段。
[0022] 能夠產(chǎn)牛感興趣的蛋白質(zhì)的微牛物
[0023] 該微生物宿主細(xì)胞可以是任何屬的宿主細(xì)胞。所希望的蛋白質(zhì)與能夠產(chǎn)生感興趣 的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞可以是同源的或異源的。
[0024] 術(shù)語"同源蛋白質(zhì)"意指由源于其中產(chǎn)生它的宿主細(xì)胞的基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0025] 術(shù)語"異源蛋白質(zhì)"意指由相對(duì)于其中產(chǎn)生它的宿主細(xì)胞為外來的基因編碼的蛋 白質(zhì)。
[0026] 如在此使用的，術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"意指包含編碼所希望的蛋白質(zhì)的基因（一種 或多種）并且能夠表達(dá)所述基因（一種或多種）而產(chǎn)生該希望的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞?？梢?使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)經(jīng)由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或諸如此類的方法使所希望的蛋白質(zhì)編碼基 因（一種或多種）進(jìn)入重組宿主細(xì)胞中。
[0027] 當(dāng)所希望的蛋白質(zhì)是一種異源蛋白質(zhì)時(shí)，能夠產(chǎn)生該希望的蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì) 胞優(yōu)選地是真菌或細(xì)菌來源的。重組宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼該希望的 蛋白質(zhì)的基因和所述蛋白質(zhì)的來源。
[0028] 如在此使用的，術(shù)語"野生型宿主細(xì)胞"是指天然地包含編碼所希望的蛋白質(zhì)的基 因（一種或多種）并且能夠表達(dá)所述基因（一種或多種）的宿主細(xì)胞。
[0029]"其突變體"可以是一種其中一個(gè)或多個(gè)基因已經(jīng)被缺失（例如，為了富集所希望 的蛋白質(zhì)制劑）的野生型宿主細(xì)胞。
[0030] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該重組或野生型微生物宿主細(xì)胞是細(xì)菌或真菌。
[0031] 該微生物宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞，例如假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母 屬、畢赤酵母屬、釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬菌株。在另一方面，該菌株是卡爾 斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵母、諾地酵母、或卵形酵母菌株。
[0032]該微生物宿主細(xì)胞可以是絲狀真茵菌株，例如枝頂孢屬（Acremonium)、 傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢屬（Alternaria)、曲霉菌屬（Aspergillus)、短梗霉屬 (Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬（Botryospaeria)、擬賭菌屬（Ceriporiopsis)、毛 口彖殼屬（Chaetomidium)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋孢 腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬 (Corynascus)、隱叢赤殼菌屬（Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱屬 (Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、赤 霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲屬（Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、耙齒菌 屬（Irpex)、香葫屬（Lentinula)、小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨孢屬（Magnaporthe)、 黑果菌屬（Melanocarpus)、亞灰樹花菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉 屬（Myceliophthora)、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、鏈抱菌屬（Neurospora)、擬 青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤 胃壺菌屬（Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲屬 (Pseudotrichonympha)、根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、柱頂 孢屬（Scytalidium)、踝節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢 殼霉屬（Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌 屬（Trichophaea)、輪枝孢屬（Verticillium)、小包腳蒴屬（Volvariella)、或炭角菌屬 (Xylaria)菌株。
[0033]在另一方面，該菌株是解纖維枝頂孢霉（Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillusfumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、構(gòu) 巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、拉克悼金抱子菌（Chrysosporiumlucknowense)、類狀金抱子菌 (Chrysosporiummerdarium)、毯金抱子菌（Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子 菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金抱子菌（Chrysosporiumtropicum)、帶紋 金抱子菌（Chrysosporiumzonatum)、桿抱狀鏡抱（Fusariumbactridioides)、禾谷鏡 抱（Fusariumcerealis)、庫威鏡抱（Fusariumcrookwellense)、黃色鏡刀菌（Fusarium culmorum)、禾谷鏡刀菌（Fusariumgraminearum)、禾赤鏡抱（Fusariumgraminum)、異抱 鏡抱（Fusariumheterosporum)、合歡木鏡抱（Fusariumnegundi)、尖抱鏡刀菌（Fusarium oxysporum)、多枝鏡抱（Fusariumreticulatum)、粉紅鏡抱菌（Fusariumroseum)、接 骨木鏡抱（Fusariumsambucinum)、膚色鏡抱（Fusariumsarcochroum)、擬枝抱鏡刀菌 (Fusariumsporotrichioides)、硫色鏡刀菌（Fusariumsulphureum)、圓鏡抱（Fusarium torulosum)、擬絲抱鏡刀菌（Fusariumtrichothecioides)、鑲片鏡抱菌（Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉（Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)、疏棉狀腐 質(zhì)霉（Humicolalanuginosa)、白囊耙齒菌（Irpexlacteus)、米黑毛霉（Mucormiehei)、 嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌（Neurosporacrassa)、繩狀 青霉菌（Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉（Penicilliumpurpurogenum)、黃抱原 毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼（Thielaviaachromatica)、 成層梭抱殼菌（Thielaviaalbomyces)、白毛梭抱殼（Thielaviaalbopilosa)、澳洲 梭抱殼（Thielaviaaustraleinsis)、類梭抱殼（Thielaviafimeti)、小抱梭抱殼 (Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼（Thielaviaovispora)、秘魯梭抱殼（Thielavia peruviana)、毛梭抱殼（Thielaviasetosa)、瘤抱梭抱殼（Thielaviaspededonium)、耐熱 梭抱殼（Thielaviasubthermophila)、土生梭抱殼（Thielaviaterrestris)、哈茨木霉 (Trichodermaharzianum)、康寧木霉（Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、或綠色木霉（Trichodermaviride) 菌株。
[0034] 在一方面，該真菌