一種尖孢鐮孢菌及其菌劑和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種尖孢鐮孢菌，還涉及利用該尖孢鐮孢菌 生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 列當(dāng)屬于列當(dāng)科（Orobanchaceae)列當(dāng)屬（Orobanche)，是一年生根寄生雜草，寄 生于某些高等植物根上，無葉綠素和根系，以吸盤從寄主植物體內(nèi)攝取養(yǎng)分和水分。寄主 被寄生后，植株表現(xiàn)為生長緩慢、矮化、黃化、萎蔫或枯死等，造成農(nóng)作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)下 降，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致農(nóng)作物絕收。列當(dāng)?shù)募闹鞣秶鷱V泛，可寄生在菊科、豆科、茄科、萌蘆科、十 字花科、大麻科、亞麻科、傘形科和禾本科等植物根上。列當(dāng)?shù)姆敝沉?qiáng)，每株可產(chǎn)生種子約 10萬粒；列當(dāng)種子存活期長，在土壤中列當(dāng)種子的生活力可保持8-10年。在適宜溫濕度下， 種子終年可以萌發(fā)，在作物的整個(gè)生育期內(nèi)都會(huì)有列當(dāng)出土，參差不齊，這種特性使其成為 非常難防的惡性雜草。在我國，危害較大的列當(dāng)主要是向日葵列當(dāng)、分枝列當(dāng)和埃及列當(dāng)。 近年來列當(dāng)在河北、山西、內(nèi)蒙古、新疆等地大面積爆發(fā)，重度田塊寄生率達(dá)100%，損失巨 大。
[0003] 目前防治列當(dāng)?shù)姆椒ㄖ饕遣捎酶?、栽培技術(shù)措施或施用化學(xué)藥劑；但是由于 列當(dāng)種子產(chǎn)生量大，種子存活期長，且在適宜溫濕度下，種子終年可以萌發(fā)，在作物的整個(gè) 生育期內(nèi)都會(huì)有列當(dāng)出土，參差不齊，使得現(xiàn)有技術(shù)措施的防治效果非常差。
[0004] 利用雜草的病原微生物研制?；詮?qiáng)、對目標(biāo)雜草以外的植物影響小、環(huán)境 負(fù)效應(yīng)少、安全性高的生物除草劑，有可能成為防除雜草的有效途徑。如鐮刀菌屬 (Fusarium spp.)的某些種可以侵染列當(dāng)，引起發(fā)病。王之樾（王之樾等·新疆農(nóng)業(yè)科 技.1981(7) :16-17。王之樾等.中國生物防治.1985(1) :24-26)從田間自然罹病的列當(dāng) 上分離到一株鐮刀菌（Fusarium orobanches)并制成生防劑F798,用割莖涂液法防治哈密 瓜列當(dāng)，但是該方法需要先將列當(dāng)?shù)那o部割斷，再涂抹上生防菌液，操作非常麻煩、推廣比 較困難，影響防治效果。尖抱鏡刀菌（Fusarium oxysporum) (Heiko Thomas等.Annals of Botany. 1999. 83:453-458)能夠在向日葵列當(dāng)?shù)牡叵律L階段進(jìn)行侵染，顯著降低列當(dāng)種 子的萌發(fā)和寄生率。鐮刀菌L2菌株（孔令曉等.植物病理學(xué)報(bào).2006 36(5):466-469) 對列當(dāng)?shù)姆乐涡Ч_(dá)到92.4%，L2菌株粗毒素能夠抑制列當(dāng)種子萌發(fā)，并造成列當(dāng)種 子萌芽管損傷。利用生防鐮刀菌防治煙草列當(dāng)可減輕列當(dāng)?shù)奈：Γ▍窃A等.煙草科 技.2012 (10) : 78-80)，但是此種方法需要先用硫磺調(diào)節(jié)土壤的酸堿度再穴施生防鐮刀菌， 比較費(fèi)事，且防治效果有限；專利《一種層出鐮孢菌及其菌劑和應(yīng)用》（ZL201010209217. 5) 公開了利用層出鐮孢菌防治向日葵列當(dāng)，其田間防治效果可達(dá)61. 7%。從以上可以看出，鐮 刀菌是防治列當(dāng)?shù)挠行緩?，但是現(xiàn)有的鐮刀菌還存在防治范圍有限，發(fā)酵水平低，防治效 果受環(huán)境影響較大等缺點(diǎn)，亟需尋找新的能高效和長效防治列當(dāng)?shù)溺牭毒ο鄳?yīng)的菌 劑的制備方法進(jìn)行研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對培育抗列當(dāng)品種難，栽培措施防治效果差和化學(xué)農(nóng)藥防治帶來的污染環(huán)境等 問題，本發(fā)明目的在于提供一種尖孢鐮孢菌。該菌可高效、長效抑制分枝列當(dāng)和彎管列當(dāng)， 并對列當(dāng)?shù)募闹髦参锏纳L具有促進(jìn)作用。
[0006] 本發(fā)明第二目的在于提供利用上述尖孢鐮孢菌生產(chǎn)的微生物菌劑。
[0007] 本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明第四目的在于提供上述尖孢鐮孢菌在防治番茄、煙草和向日葵上寄生的分 枝列當(dāng)和彎管列當(dāng)上的用途。
[0009] 本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治番茄、煙草和向日葵上寄生的分 枝列當(dāng)和彎管列當(dāng)上的用途。
[0010] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] -種尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum，亦稱尖孢鐮刀菌）菌株Br_2,己于2015 年1月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏地址為：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研宄所），保藏編號(hào)為CGMCC No. 10324。
[0012] 利用上述尖孢鐮孢菌生產(chǎn)的微生物菌劑，所述的微生物菌劑含有尖孢鐮孢菌Br-2 菌體和發(fā)酵液。
[0013] 上述微生物菌劑為固體制劑，所述的固體制劑中的尖孢鐮孢菌Br-2的活菌數(shù)大 于 lX108cfu/g〇
[0014] 上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0015] (1)菌種活化：將低溫保存的Br-2菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，在25°C活化培 養(yǎng)72h，在菌落邊緣用直徑5_的打孔器打出菌片，得Br-2菌片；
[0016] (2)種子液制備：將步驟（1)活化的Br-2菌片接種于PDB液體培養(yǎng)基中，每200ml PDB液體培養(yǎng)基接種Br-2菌片4~5片，在25~26°C、轉(zhuǎn)速170/rpm下振蕩培養(yǎng)48~72h， 得Br-2種子液；
[0017] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：向發(fā)酵罐加入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值用HCl調(diào)為5,滅菌后待溫度 降到25°C以下時(shí)采用負(fù)壓方法按照重量百分比為0.5~1%的比例接入步驟（2)所得的 Br-2種子液，在溫度為25~30°C、通氣量為1:0. 3~1. 0、攪拌速度為160~200rpm條件 下發(fā)酵培養(yǎng)48~96h ;
[0018] (4)發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后，檢測發(fā)酵液中分生孢子數(shù)量，待發(fā)酵液中分生孢子數(shù)量 達(dá)到IO 8即可停止發(fā)酵培養(yǎng)；離心濃縮10倍，所得即為Br-2菌株的液體制劑；
[0019] (5)按照1:1的重量比向步驟⑷所得的Br-2菌株的液體菌劑中加入助劑，混勻 干燥后即為Br-2菌株的固體制劑。
[0020] 上述制備方法步驟（1)所述的PDA培養(yǎng)基的組成成份及其重量百分比為：馬鈴薯 20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，其余為水。
[0021] 上述制備方法步驟（2)中所述的其中PDB液體培養(yǎng)基組成成份及其重量百分比 為：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，其余為水。
[0022] 上述制備方法步驟（3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成份及其重量百分比為：蔗糖 2~4 %，硫酸銨0· 3~0· 5 %，磷酸氫二鉀0· 08~0· 15 %，硫酸鎂0· 03~0· 06 %，氯化鉀 0· 08~0· 15%和硫酸亞鐵0· 001~0· 01%，其余為水。
[0023] 上述制備方法步驟（3)中所述的通氣量優(yōu)選為0~24h 1:0. 3 ; 24~48h1:0. 6 ; 48 ~96h 1:1。
[0024] 上述制備方法步驟（3)中所述的通氣量是指每分鐘通入發(fā)酵罐的空氣體積與發(fā) 酵罐中發(fā)酵液的體積比。
[0025] 上述制備方法步驟（3)中所述的攪拌速度優(yōu)選為160~170rpm。
[0026] 上述制備方法步驟（3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為48~60h。
[0027] 上述制備方法步驟（5)中所述的助劑為娃藻土或麥麩。
[0028] 上述尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum)菌株Br_2在防治分枝列當(dāng)（Orobanche acgyptiaca Pers.)或彎管列當(dāng)（Orobanche cernua Loefling)上的應(yīng)用。
[0029] 上述微生物菌劑在防治分枝列當(dāng)（Orobanche acgyptiaca Pers.)或彎管列當(dāng) (Orobanche cernua Loefling)上的應(yīng)用。
[0030] 上述應(yīng)用中所述列當(dāng)?shù)募闹鞣謩e為番茄、向日葵或煙草等。
[0031] 本發(fā)明尖孢鐮孢菌Br-2對10種主要作物（包括單子葉和雙子葉植物）小麥、甜 瓜、西瓜、茄子、棉花、玉米、煙草、向日葵、辣椒、番茄等10種作物沒有致病現(xiàn)象，表現(xiàn)對作 物安全而且具有促生長作用。
[0032] 本發(fā)明尖孢鐮孢菌微生物菌劑的使用方法：將上述所得微生物菌劑在番茄、煙草 育苗期土壤中施用，也可將上述所得微生物菌劑用于番茄、煙草移栽期或向日葵播種期根 施。
[0033] Br-2菌株的分離篩選過程
[0034] Br-2菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研宄所從河北省張家口蔚縣寄生于煙草 的感病列當(dāng)上分離得到的。2010年9月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研宄所從河北張家口煙 草地中地采集發(fā)病的彎管列當(dāng)植株，表面消毒后切取感病植株莖部組織擺放于PDA平板培 養(yǎng)基上培養(yǎng)得到真菌菌株，對這些菌株進(jìn)行純化，經(jīng)過在10種作物上的安全性檢測后，篩 選出對作物無致病作用且有促生長作用的菌株，在煙草、番茄、向日葵列當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重的地塊 采用作物根部土壤施用進(jìn)行篩選，從中得到一株對分枝列當(dāng)和彎管列當(dāng)具有明顯的防治效 果的菌株，定名為Br-2。
[0035] Br-2菌株的分類：
[0036] (一）根據(jù)形態(tài)特征分類
[0037] 菌株Br-2在PDA平面培養(yǎng)基上25 °C培養(yǎng)，菌落呈發(fā)射狀生長，菌落顏色白色，隨著 培養(yǎng)時(shí)間增長中心菌絲變?yōu)榈仙苌佼a(chǎn)生大型分生孢子，多數(shù)為小型分生孢子。大型分 生孢子無色呈紡錘形或鐮刀形，分隔1-5個(gè)，一般3個(gè)，頂端細(xì)胞較長，漸尖，偶見足細(xì)胞，大 小約為30-43 μηιΧ3. 5-4. 3 μπι ;小型分生孢子無色，橢圓形或卵圓形，無隔或偶見1分隔， 大小為5-17 μ mX 2-5 μ m，假頭狀著生于側(cè)生瓶狀小梗上，分生孢子梗短；厚垣孢子間生或 頂生于菌絲或大形分生孢子上，單獨(dú)或呈鏈狀，壁透明，光滑或粗糙，直徑5-13 μ m。根據(jù) 鏡刀菌鑒定手冊《The Fusarium Laboratory Manual》（John F 等.Summerell, Blackwell Publishing, 2006)，Br-2的形態(tài)特征（見圖1、圖2、圖3和圖4)與尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum，亦稱尖孢鐮刀菌）的形態(tài)特征描述相符合，說明Br-2屬于鐮刀菌屬尖孢鐮孢菌 (Fusarium oxysporum)〇
[0038] (二）根據(jù)翻譯延長因子I- a (EFl- α )基因序列進(jìn)行分類
[0039] 提取fc-2基因組DNA，以fc-2基因組DNA為模板，以下述EFl- a F和EFl- a R 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物序列為：EFl-a F 5' -ATG GGT AAG GA(AG)GAC