一種利用微生物共發(fā)酵c5和c6生產(chǎn)乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 諸多如石油等不可再生的化石能源日益枯竭，使得可再生能源特別是生物燃料受 到越來越多的關(guān)注，并帶來巨大的商機(jī)和社會(huì)意義。
[0003] 根據(jù)際能源署（IEA)的相關(guān)定義，常規(guī)生物燃料包括糖基和淀粉基乙醇、油料作物 基生物柴油、可直接利用的植物油以及通過厭氧消化制得的沼氣；先進(jìn)生物燃料技術(shù)指還 處于研發(fā)、中試或示范階段的轉(zhuǎn)化技術(shù)，通常稱為第二代技術(shù)或第三代技術(shù)。這一類別包括 用動(dòng)物脂肪和植物油煉制的加氫植物油（HV0)，以及用含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)的生物燃 料，比如乙醇、費(fèi)托液和合成天然氣。
[0004] 乙醇是清潔的可再生液體燃料，許多國家已經(jīng)開始使用添加了一定比例乙醇的汽 油一汽油醇，以代替汽油的消耗。這種新型燃料既能緩解石油的消耗速率，又可以減少汽車 尾氣污染，具有極大的應(yīng)用和發(fā)展?jié)摿?。我國?001年起開始推廣使用汽油醇，目前汽油 醇占汽油類燃料總消耗量的約20%，并處于逐年增長的勢頭。
[0005] 目前國內(nèi)外生產(chǎn)乙醇所使用的主要原料是玉米等糧食作物。隨著世界人口的不斷 增長，糧食日益短缺，因此從長遠(yuǎn)來看，糧食作物不是生產(chǎn)乙醇的理想原料。同時(shí)，每年有大 量的農(nóng)林業(yè)廢棄木質(zhì)纖維材料(如玉米秸桿等）用焚燒等的方式不當(dāng)處理，不僅造成了原料 的浪費(fèi)，而且污染了環(huán)境。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成，在農(nóng)業(yè)廢棄木 質(zhì)纖維材料中三者的含量大約是：纖維素占30~40%，半纖維素占20~30%，木質(zhì)素占10~ 25%。其中葡萄糖是纖維素的主要組成單元，木糖是半纖維素的主要組成單元。在植物纖維 材料水解液中木糖占30%左右，是繼葡萄糖之后自然界最豐富的糖分，因而利用葡萄糖木 糖共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇原材料豐富，具有廣闊的市場前景。
[0006] -般而言，用含木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)進(jìn)行生物燃料的生產(chǎn)屬于先進(jìn)生物燃料技術(shù) 范疇。利用含木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇通常采用生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的工藝，包括預(yù)處理、水解、 發(fā)酵和回收等步驟。經(jīng)過預(yù)處理，增加了酶和纖維素材料的可接近性，從而提高原材料的可 利用性；水解(包括酶解）以后，半纖維素主要分解為C5糖，而纖維素主要分解為C6糖。由 于半纖維素的無定型結(jié)構(gòu)，其更容易被水解為C5糖。在預(yù)處理階段和酶解階段，會(huì)得部分 發(fā)酵抑制物，例如甲酸、乙酸、糠醛等。
[0007] 但是，相應(yīng)面臨的困境是，自然界中能高效產(chǎn)醇的微生物通常只能利用葡萄糖等 六碳糖生產(chǎn)乙醇，不能利用木糖；而少數(shù)能利用木糖產(chǎn)醇的微生物，產(chǎn)醇能力低下，這限制 了對自然界中木質(zhì)纖維素的有效利用。通過代謝工程對微生物進(jìn)行改造，并利用其代謝轉(zhuǎn) 化C5糖主要經(jīng)過以下反應(yīng)：木糖還原酶依賴NADPH將木糖還原為木糖醇，木糖醇再在木糖 醇脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為木酮糖；再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，然后進(jìn)入磷酸 戊糖途徑（PPP)。PPP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過酵解途徑形成 丙酮酸，丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶脫羧還原為乙醇。
[0008] 在基因工程技術(shù)的推動(dòng)下，研究人員獲得了一批可以利用木糖代謝生產(chǎn)乙醇的重 組發(fā)酵微生物。然而，在實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)中，尤其是大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化階段，生產(chǎn)中轉(zhuǎn)化率過 低，成為限制這一技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 因此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中微生物共發(fā)酵C5糖和C6糖產(chǎn)乙醇過程 中對發(fā)酵供給的差異性消耗需求，并導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)中轉(zhuǎn)化率過低的缺陷，從而提供一種能 夠高效利用微生物共發(fā)酵C5糖和C6糖生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝。
[0010] 為此,本發(fā)明提供一種利用微生物共發(fā)酵C5和C6生產(chǎn)乙醇的方法，包括如下步 驟：
[0011] 1)、將所述微生物擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液；
[0012] 2)、將所述擴(kuò)大培養(yǎng)液按5-20%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制反應(yīng)溫度25_38°C、 pH5. 0-7. 0進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，控制所述發(fā)酵生產(chǎn)過程中進(jìn)行間歇式供氧，通氣量0. 01-0. 5mL/ L/min，通氣時(shí)間為0. 5h，間隔時(shí)間為5-6h，得到發(fā)酵液；
[0013] 3)、分離所述發(fā)酵液獲得乙醇。
[0014] 所述步驟2)中，控制發(fā)酵過程中空氣通氣量為0. 1-0. 2mL/L/min，通氣時(shí)間0. 5h， 間隔時(shí)間為5-6h。
[0015] 所述擴(kuò)大培養(yǎng)是指將培養(yǎng)所述微生物得到的種子液接種至擴(kuò)大培養(yǎng)基中，通過至 少一級的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在所述擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，通過調(diào)節(jié)擴(kuò) 大培養(yǎng)過程中的供氧濃度實(shí)現(xiàn)對所述微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0016] 前述發(fā)酵步驟中，所述間歇式供氧方式，即為每通氣0. 5h后停止通氣5_6h。
[0017] 所述通氣量單位mL/L/min，是指單位時(shí)間內(nèi)單位體積發(fā)酵液通入的空氣體積，即 每分鐘內(nèi)每升發(fā)酵液中通入的空氣體積（mL量)。
[0018] 使用一級的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟：
[0019] 將所述種子液按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級擴(kuò)培罐中， 控制溫度 25-35°C、ρΗ4-6· 5、轉(zhuǎn)速 180-220rpm、通氣量 0· 08-0. 5L/L/min，擴(kuò)大培養(yǎng) 6-12h ; 隨后調(diào)整轉(zhuǎn)速40-100rpm、通氣量0. 18-0. 5L/L/min，擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到 0· 1-0. 5X109f/mL。
[0020] 使用二級的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟：
[0021] 1)將所述種子液按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級擴(kuò)培罐 中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5L/L/min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 至所述微生物濃度達(dá)到0. 2-0. 3 X IO9個(gè)/mL ;
[0022] 2)將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培 養(yǎng)基的二級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-100rpm、通氣量0. 18-0. 5L/L/ min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（0. 1-0. 5) X IO9個(gè)/mL。
[0023] 使用三級的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟：
[0024] 1)將所述種子液按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級擴(kuò)培罐 中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5L/L/min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 至所述微生物濃度達(dá)到0. l-o. 5 X IO9個(gè)/mL ;
[0025] 2)將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培 養(yǎng)基的二級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-100rpm、通氣量0. 18-0. 5L/L/ min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到0. 1-0. 5 X IO9個(gè)/mL ;
[0026] 3)將步驟2)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng) 基的三級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 01-0. 2L/L/min， 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到（0. 2-0. 3) X IO9個(gè)/mL。
[0027] 使用四級的擴(kuò)大培養(yǎng)步驟對所述微生物進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，包括如下步驟：
[0028] 1)將所述種子液按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的一級擴(kuò)培罐 中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速180-220rpm、通氣量0. 08-0. 5L/L/min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 至所述微生物濃度達(dá)到0. 1-0. 5 X IO9個(gè)/mL ;
[0029] 2)將步驟1)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng) 基的二級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 18-0. 5L/L/min， 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到0. 1-0. 5 X IO9個(gè)/mL ;
[0030] 3)將步驟2)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng) 基的三級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 01-0. 2L/L/min， 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至所述微生物濃度達(dá)到0. 1-0. 5 X IO9個(gè)/mL ;
[0031] 4)將步驟3)中得到的擴(kuò)培微生物按照5-20%的接種量接種至含有所述擴(kuò)大培養(yǎng) 基的四級擴(kuò)培罐中，控制溫度25-35°C、pH4-6. 5、轉(zhuǎn)速40-60rpm、通氣量0. 0005-0. 02L/L/ min，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)12-24h。
[0032] 前述擴(kuò)大培養(yǎng)步驟中，所述通氣量單位L/L/min，是指單位時(shí)間內(nèi)單位體積發(fā)酵液 通入的空氣體積，即每分鐘內(nèi)每升發(fā)酵液中通入的空氣體積（L)。
[0033] 所述各級擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，一級擴(kuò)培罐為50L擴(kuò)培罐，二級擴(kuò)培罐為500L擴(kuò)培罐， 三級擴(kuò)培罐為5立方擴(kuò)培罐，四級擴(kuò)培罐為50立方擴(kuò)培罐。
[0034] 所述各級擴(kuò)大培養(yǎng)的過程中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基彼此獨(dú)立的含有玉米糖化醪、糖蜜、 葡萄糖、甜高粱莖桿汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種做為碳源；含有黃豆餅粉、 玉米餅粉、玉米漿、魚粉、酵母膏中的一種或幾種做為氮源；并且選擇性的含有尿素、無機(jī) 鹽、氨基酸、微量元素和/或抑制劑。
[0035] 所述擴(kuò)大培養(yǎng)能夠?yàn)楹罄m(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇步驟提供足夠多的微生物數(shù)量，其中擴(kuò)大 培養(yǎng)基是微生物獲得生存的營養(yǎng)來源，對微生物生長繁殖、酶的活性與產(chǎn)量都有直接的影 響。
[0036] 所述擴(kuò)大培養(yǎng)基選擇性的包括蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿汁 或木質(zhì)纖維素原料酶解液。
[0037] 作為一種優(yōu)選，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基為蛋白胨、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱莖桿 汁或木質(zhì)纖維素原料酶解液中的一種或幾種，并且所述擴(kuò)大培養(yǎng)基中葡萄糖的含量按重量 百分比含量為2-10%，優(yōu)選含量為4-6%。
[0038] 作為另一種優(yōu)選，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基中含有4%重量百分比葡萄糖的培養(yǎng)基，或者含 重量百分比為4%葡萄糖的玉米糖化醪或糖蜜。
[0039] 作為另外一種優(yōu)選方案，所述擴(kuò)大培養(yǎng)基還可以是按重量百分比稀釋濃度為 10-75%的木質(zhì)纖維素原料酶解液，其中所述木質(zhì)纖維原料酶解液未被稀釋時(shí)按重量百分比 含有葡萄糖1-12%、木糖1-7% ;優(yōu)選的，葡萄糖含量為5-10%，木糖含量優(yōu)選為3-6% ;更優(yōu)選 的，葡萄糖含量為6-9%，木糖含量為3-5%。優(yōu)選的，所述木質(zhì)纖維素原料酶解液作為所述擴(kuò) 大培養(yǎng)基時(shí)，其按重量百分比稀釋濃度為20-30%。