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      一種測定雜交水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法

      文檔序號:8484012閱讀:655來源:國知局
      一種測定雜交水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種測定雜交水稻新品種的特異性、一致性 與穩(wěn)定性的方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 作為一種特化的知識產(chǎn)權(quán),植物新品種已經(jīng)成為一個公司及至一個國家的核心競 爭力。植物新品種授權(quán)與相關(guān)法律問題的解決依賴于DUS測試,即對待測水稻品種的特異 性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)的田間種植鑒定或室內(nèi)分 子標(biāo)記鑒定。田間種植鑒定流程為:將待測水稻品種與近似品種同時植于田間,在2年及以 上的生長季節(jié)內(nèi),觀察它們的多個性狀,根據(jù)性狀表現(xiàn)判斷待測水稻品種與近似品種的差 異顯著性,即特異性,同時判斷群體內(nèi)雜株比例,即一致性和穩(wěn)定性;室內(nèi)分子標(biāo)記鑒定的 流程為:分單株提取待測水稻品種與近似品種中每個樣本的DNA,并分別對每個樣本的每 個測試區(qū)域進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)),并對每個PCR產(chǎn)物進(jìn) 行電泳或一代測序檢測,根據(jù)檢測結(jié)果,獲得待測水稻品種與近似品種的差異位點(diǎn)比例,根 據(jù)差異位點(diǎn)比例,判斷待測水稻品種的特異性。
      [0003] 田間種植鑒定的缺點(diǎn)是:周期長、工作量大,環(huán)境影響性狀,導(dǎo)致判斷不準(zhǔn)確。室內(nèi) 分子標(biāo)記鑒定的缺點(diǎn)是:需要分別處理每個樣本的每個測試區(qū)域,工作量大,不能對樣本與 測試區(qū)域大量抽樣,無法計算雜株率,因而無法進(jìn)行穩(wěn)定性與一致性的測試。田間種植鑒定 與室內(nèi)分子標(biāo)記鑒定的共同缺點(diǎn)是:均由于工作量大的原因,無法從現(xiàn)有品種中客觀選擇 近似品種,只能由品種權(quán)申請人提供,而基于商業(yè)利益等動機(jī),品種權(quán)申請人提供的近似品 種可能不真實(shí),從而造成錯誤品種授權(quán)的法律后果。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題,本發(fā)明實(shí)施例提供了一種測定雜交水稻新品種的特 異性、一致性與穩(wěn)定性的方法。所述技術(shù)方案如下:
      [0005] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種測定雜交水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方 法,所述方法包括:
      [0006] 獲得不同水稻品種間的變異位點(diǎn);
      [0007] 通過所述變異位點(diǎn)確定所述待測水稻品種的測試區(qū)域,所述測試區(qū)域包括通用測 試區(qū)域,至少部分所述變異位點(diǎn)包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi);
      [0008] 構(gòu)建包含所述不同品種的在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫;
      [0009] 確定所述待測水稻品種的抽樣量SN后,隨機(jī)抽樣混合并提取混合樣本的DNA ;
      [0010] 制備擴(kuò)增所述測試區(qū)域的引物,所述引物包括所述通用測試區(qū)域引物;
      [0011] 利用所述引物對所述混合樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到所述測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物, 所述擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建高通量測序文庫;
      [0012] 對所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序,得到測序片段組;
      [0013] 分析所述測序片段組,獲得待測水稻品種基因型和雜株基因型;
      [0014] 將所述待測水稻品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較,獲得 所述待測水稻品種的近似品種、變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)率;
      [0015] 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較,獲得雜株品種 后,計算雜株率;
      [0016] 利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率,判斷所述待測水稻品種特異 性、一致性和穩(wěn)定性。
      [0017] 具體地,所述抽樣量5抑茜足如下條件出預(yù)0^1階^]?,0.95)/5^^彡1.15柳,其中 ΒΙΝ0Μ. INV為excel 2010中的函數(shù),M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值,所述抽 樣量SN滿足的條件含義為:即使所述雜株率只超出一致性和穩(wěn)定性的判斷閾值M的15%, 所述抽樣量在95%的概率保證下,可正確判斷所述待測水稻品種的穩(wěn)定性與一致性。
      [0018] 具體地,所述高通量測序的深度CF滿足如下條件:BIN0M. DIST (10, 10, BI NOM. DIST(8, 20, BINOM. DIST(0, CF, 0. 1 % , TRUE), TRUE), FALSE) ^99.9 %, I-BIN 0M. DIST (10000, 10000, 1-BIN0M. DIST (8, 20, 1-BIN0M. DIST (99. 99 % *CF, CF, 99. 9 989 %,TRUE),TRUE),F(xiàn)ALSE)彡 0.1 % 且 BIN0M.DIST(10*(1-M)*CF,10*CF,1-110 % *M,TRUE)多95. 0 %,其中,CF為所述高通量測序的深度,M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所 選用的閾值,BINOM. DIST為excel 2010中的函數(shù),所述高通量測序的深度CF滿足的條件 含義為:在所述雜株率低至〇. 1 %、所述雜株品種為10個且所述雜株品種與所述待測水稻 品種間平均僅有20個差異位點(diǎn)的條件下,由所述高通量測序的深度CF決定的檢出全部所 述雜株品種的概率多99. 9% ;在所述數(shù)據(jù)庫的品種為10000個且所述雜株品種與所述待測 水稻品種間平均僅有20個差異位點(diǎn)的條件下,由所述高通量測序的深度CF決定的存在誤 判所述雜株品種的概率< 〇. 1% ;在所述雜株品種為10個且真實(shí)雜株率僅超過判斷特異性 時所選用的閾值的10%時,由所述高通量測序的深度CF決定的對穩(wěn)定性與一致性的判定 結(jié)論正確的概率彡95.0%。
      [0019] 具體地,所述測試區(qū)域還包括非通用測試區(qū)域,所述引物還包括非通用測試區(qū)域 引物。
      [0020] 進(jìn)一步地,所述非通用測試區(qū)域引物包括第一引物和第二引物,所述第一引物包 括第一正向引物和第一反向引物,所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物,所述 第一引物和所述第二引物分別進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增得到兩個所述非通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物,將 兩個所述非通用測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合用于構(gòu)建單獨(dú)擴(kuò)增的高通量測序文庫;
      [0021] 所述第一正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1,所述第 一反向引物中的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2 ;
      [0022] 所述第二正向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列2,所述第 二反向引物的5'端連接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。
      [0023] 進(jìn)一步地,利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率,判斷所述待測水稻 品種特異性、一致性和穩(wěn)定性的方法包括:
      [0024] 當(dāng)所述變異位點(diǎn)率多SD或所述非通用測試區(qū)域存在所述變異位點(diǎn)時,所述待測 水稻品種具有特異性,當(dāng)所述變異位點(diǎn)率< SD且所述變異位點(diǎn)不存在于所述非通用測試 區(qū)域時,所述待測水稻品種不具有特異性,其中SD為判斷特異性時所選用的閾值;
      [0025] 當(dāng)所述待測水稻品種的所述雜株率< M時,所述待測水稻品種具有一致性和穩(wěn)定 性,當(dāng)所述待測水稻品種的所述雜株率大于> M時,所述待測水稻品種不具有一致性和穩(wěn) 定性,M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值;
      [0026] 所述雜株率 R = Rl+R2-R3_R4+Rm,其中:
      [0027]
      【主權(quán)項】
      1. 一種測定雜交水稻新品種的特異性、一致性與穩(wěn)定性的方法,其特征在于,所述方法 包括: 獲得不同水稻品種間的變異位點(diǎn); 通過所述變異位點(diǎn)確定所述待測水稻品種的測試區(qū)域,所述測試區(qū)域包括通用測試區(qū) 域,至少部分所述變異位點(diǎn)包含在所述通用測試區(qū)域內(nèi); 構(gòu)建包含所述不同品種在所有所述測試區(qū)域的基因型的數(shù)據(jù)庫; 確定所述待測水稻品種的抽樣量SN后,隨機(jī)抽樣混合并提取混合樣本的DNA ; 制備擴(kuò)增所述測試區(qū)域的引物,所述引物包括所述通用測試區(qū)域引物; 利用所述引物對所述混合樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到所述測試區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物,所述 擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建高通量測序文庫; 對所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序,得到測序片段組; 分析所述測序片段組,獲得待測水稻品種基因型和雜株基因型; 將所述待測水稻品種基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較,獲得所述 待測水稻品種的近似品種、變異位點(diǎn)和變異位點(diǎn)率; 將所述雜株基因型與所述數(shù)據(jù)庫中的所述不同品種的基因型比較,獲得雜株品種后, 計算雜株率; 利用所述變異位點(diǎn)、所述變異位點(diǎn)率和所述雜株率,判斷所述待測水稻品種特異性、一 致性和穩(wěn)定性。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述抽樣量SN滿足如下條件:BINOM. 1階^]?,0.95)/5^^彡1.15柳,其中81勵^1階為61〇612010中的函數(shù),]\1為判斷所述一 致性和穩(wěn)定性時所選用的閾值,所述抽樣量SN滿足的條件含義為:即使所述雜株率只超出 閾值M的15%,所述抽樣量在95%的概率保證下,可正確判斷所述待測水稻品種的穩(wěn)定性 與一致性。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述高通量測序的深度CF滿足如下條 件:BINOM. DIST (10, 10, BINOM. DIST (8, 20, BINOM. DIST (0, CF,0? 1 %,TRUE),TRUE),F(xiàn)ALSE) ^99. 9%, 1-BINOM. DIST(10000, 10000, 1-BINOM. DIST(8, 20, 1-BINOM. DIST(99. 99% *CF, C F,99.9989%,TRUE),TRUE),F(xiàn)ALSE)彡 0? 1%且 BINO M.DIST(10*(1-M)*CF, 10*CF, 1-110% *M,TRUE)多95. 0 %,其中,CF為所述高通量測序的深度,M為判斷所述一致性和穩(wěn)定性時所 選用的閾值,BINOM. DIST為excel 2010中的函數(shù),所述高通量測序的深度CF滿足的條件 含義為:在所述雜株率低至〇. 1 %、所述雜株品種為10個且所述雜株品種與所述待測水稻 品種間平均僅有20個差異位點(diǎn)的條件下,由所述高通量測序的深度CF決定的檢出全部所 述雜株品種的概率多99. 9% ;在所述數(shù)據(jù)庫的品種為10000個且所述雜株品種與所述待測 水稻品種間平均僅有20個差異位點(diǎn)的條件下,由所述高通量測序的深度CF決定的存在誤 判所述雜株品種的概
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