，在每個平板上用8mm打孔器均勻打出6 個小孔并標注菌號。每孔加入100UL相對應(yīng)植物乳桿菌MRS或全脂乳發(fā)酵上清液，于4°C 冰箱中擴散12h后37°C培養(yǎng)恒溫48h，觀測抑菌圈的大小。
[0047] 通過以上方法選育出具有較強抗菌和抑菌（包括對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、 弗氏志賀氏菌、甜瓜疫霉菌、婁地青霉、甜瓜枯萎菌和蘋果炭疽）性質(zhì)的植物乳桿菌菌株， 命名為植物乳桿菌L.plantarumAB-3。
[0048] 因此，本發(fā)明提供植物乳桿菌L.plantarumAB-3能夠作為抑菌劑或抗病毒成分應(yīng) 用到生物農(nóng)藥中。植物乳桿菌L.plantarumAB-3和包含植物乳桿菌L.plantarumAB-3的 組合物都可用于抑制、阻止或消除甜瓜枯萎菌、甜瓜疫霉菌、婁地青霉和蘋果炭疽引起的植 物疾病或危害，并具有對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏志賀氏菌的抑菌效果。
[0049] 含有植物乳桿菌L.plantarumAB-3農(nóng)藥組合物可根據(jù)施用加工成各種劑型，如粉 劑、可濕性粉劑、可溶性粉劑、乳劑、乳油、濃乳劑、乳膏、糊劑、膠體劑、熏煙劑、熏蒸劑、煙霧 劑、油劑、顆粒劑、微粒劑等。
[0050] 本發(fā)明的植物乳桿菌L.plantarumAB-3具有以下有益效果：
[0051] (1)所述植物乳桿菌L.plantarumAB-3能抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏 志賀氏菌的生長；
[0052] (2)植物乳桿菌L.plantarumAB-3具有良好的熱穩(wěn)定性，其發(fā)酵上清在經(jīng)過 l〇〇°C處理后出現(xiàn)抑菌率顯著增大的結(jié)果；
[0053] (3)植物乳桿菌L.plantarumAB-3發(fā)酵上清pH調(diào)到4. 0時仍有較好的抑菌活性；
[0054] (4)植物乳桿菌L.plantarumAB-3發(fā)酵上清經(jīng)中性蛋白酶處理后抑菌活性能得 到提尚；
[0055] (5)植物乳桿菌L.plantarumAB-3發(fā)酵上清具有耐貯藏特性，在常溫貯藏20d后 仍具有良好的抑菌活性；
[0056] (6)植物乳桿菌L.plantarumAB-3能抑制甜瓜疫霉菌、甜瓜疫霉菌、婁地青霉和 蘋果炭疽菌的生長，阻止或消除甜瓜疫霉病和甜瓜枯萎病。
[0057] 本發(fā)明涉及的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB-3于2014年09月15 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，地址：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏號為CGMCCNo. 9655。
【附圖說明】
[0058]圖 1L.plantarumAB-3 菌落形態(tài)圖片
[0059]圖 2L.plantarumAB-3 菌體顯微鏡圖片（X1000)
[0060] 圖3L.plantarumAB-3系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖
[0061] 圖4L.plantarumAB_3在不同濃度時的抑菌圈大小(mm)
[0062] 圖5L.plantarumAB-3不同培養(yǎng)時間時的抑菌圈大小(mm)
[0063] 圖6L.plantarumAB-3不同溫度處理后的抑菌圈大小（mm)
[0064] 圖7L.plantarumAB-3不同的pH的下的抑菌圈大小(mm)
[0065] 圖8L.plantarumAB-3經(jīng)蛋白酶處理后的抑菌圈大小(mm)
[0066] 圖9L.plantarumAB-3常溫藏后的抑菌圈大?。╩m)
[0067] 圖10L.plantarumAB-3對婁地青霉、甜瓜枯萎和蘋果炭疽菌的抑菌圈大小（mm)
【具體實施方式】
[0068] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，以下實施例僅為說明性的，本發(fā) 明并不受這些實例的限制。
[0069]本發(fā)明中的試驗菌株：所用的347株植物乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技 術(shù)與工程"教育部重點實驗室分離、鑒定并保存，它們分別分離自內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏、 甘肅、云南、四川以及蒙古國地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，347株植物乳桿菌的16S核糖體RNA信 息都已上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫。
[0070]本發(fā)明所用的指示菌真菌：甜瓜疫霉（PhytophthoradrechsleriTucker)、婁地 青霉（Penicilliumroqueforti)、甜瓜枯萎（尖孢鐮刀菌甜瓜?；?，F(xiàn).oxyspoorumf.sp. Melonis)和蘋果炭疽（Glomerellacingulate)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與工程" 教育部重點實驗室提供，面向所有的研宄者開放。
[0071] 本發(fā)明所用的指示菌腸道致病菌：大腸桿菌0157:H7(Escherchiacoli 0157:H7)、鼠傷沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumATCC13311)和弗氏志賀氏菌 (ShigellaflexneriCMCC51592)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與工程"教育部重點 實驗室提供，三株分別用不同的液體培養(yǎng)基活化，LB液體培養(yǎng)基用于腸桿菌0157:H7的活 化和傳代；NB液體培養(yǎng)基用于鼠傷沙門氏菌、弗氏志賀氏菌的活化和傳代，都以2% (V/V) 的量傳代活化三代用于抑菌試驗。
[0072] 本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基包括：
[0073]MRS培養(yǎng)基的組成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐溫 801ml、磷酸二氫鈉2g、無水乙酸鈉5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸鎂0.lg，蒸餾水 1L，調(diào)節(jié)pH至6. 2左右，瓊脂15g，121°C、15min滅菌。
[0074]M17培養(yǎng)基的組成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、抗 壞血酸0. 5g、硫酸鎂0. 25g、二鈉甘油19g、瓊脂llg、蒸餾水1L。
[0075]TPY增菌培養(yǎng)液的組成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋 白胨5g、磷酸氫二鉀2. 5g、磷酸二氫鉀2. 5g、硫酸鎂0.lg、吐溫800. 25g、L-半胱氨酸鹽酸 鹽0? 5g、15g瓊脂、蒸餾水1L，121°C、15min滅菌。
[0076]MRS液體培養(yǎng)基的組成為：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、吐 溫801ml、磷酸二氫鈉2g、無水乙酸鈉5g、朽1檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸鎂0.lg，蒸餾 水1L，調(diào)節(jié)pH至6. 2左右，121°C、15min滅菌。
[0077]LB液體培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，調(diào)節(jié)pH至 7. 0 左右，121°C、15min滅菌。
[0078] 他液體培養(yǎng)基的組成是蛋白胨1(^/1、牛肉膏3§/1、氯化鈉5 §/1，調(diào)節(jié)口11至7.4 左右，121°C、15min滅菌。
[0079] 植物乳桿菌發(fā)酵上清液的制備：把凍存管中的植物乳桿菌保藏液接種到5ml的 MRS培養(yǎng)基中，震蕩混勻，37°C恒溫培養(yǎng)24h，連續(xù)活化三代，取第三代發(fā)酵液以4000Xg離 心lOmin，取上清，上清液經(jīng)0. 22ym微膜過濾，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 指示菌：將甜瓜疫霉菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-7d，觀察 其菌落形態(tài)及最佳培養(yǎng)時間，使指示菌活力恢復(fù)至正常，用含有PBS緩沖液（含0. 05 %吐溫 80)清洗其培養(yǎng)基，清洗到90mL的PBS緩沖液中制成105cfu/ml的甜瓜疫霉菌孢子懸液。
[0081] 甜瓜枯萎菌、蘋果炭疽和婁地青霉指示菌的培養(yǎng)（或活化）條件是：將凍存管中的 指示菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基（OXOID公司）上，在28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-7d，觀察其菌落形 態(tài)鋪滿PDA培養(yǎng)基，使指示菌活力恢復(fù)至正常。
[0082] 檢測抑菌活性時，在每個平板上用7mm打孔器均勻打出2個小孔并標注植物乳桿 菌的菌號，每孔加入100yL相對應(yīng)植物乳桿菌MRS發(fā)酵上清液，于4°C冰箱中擴散12h后 37°C培養(yǎng)恒溫48h，用游標卡尺測量抑菌圈的大小。
[0083] 實施例1植物乳桿菌AB-3對甜瓜疫霉菌、婁地青霉、甜瓜枯萎和蘋果炭疽的抑制 活性測定。
[0084] 用打孔擴散法進行試驗，在每個平板上用7_打孔器均勻打出2個小孔并標注植 物乳桿菌AB-3的試驗編號，每孔加入100yL該植物乳桿菌的MRS發(fā)酵上清液，于4°C冰箱 中擴散12h后28°C培養(yǎng)恒溫48h，觀測抑菌圈的大小，用游標卡尺測量甜瓜疫霉菌菌株的抑 菌圈大小。L.plantarumAB-3的MRS發(fā)酵上清液的抑菌效果如表1。
[0085] 表1L.plantarumAB-3的對甜瓜疫霉菌抑菌圈大?。╩m)
【主權(quán)項】
1. 一株具有抑菌活性的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_3,該植物乳桿菌 已于2014年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保 藏，保藏號為CGMCCNo. 9655。
2. 含有如權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌的組合物。
3. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌抑制致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述制致病菌包括： (1) 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏志賀氏菌；和 (2) 甜瓜疫霉菌、婁地青霉、甜瓜枯萎菌和蘋果炭疽。
4. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌作為發(fā)酵劑或食品添加劑在食品中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在植物生物農(nóng)藥或果蔬保鮮劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)AB-3，保藏號為CGMCC No.9655。本發(fā)明的植物乳桿菌L.plantarum AB-3表現(xiàn)出對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和弗氏志賀氏菌的有效抑制性；表現(xiàn)出對甜瓜疫霉、甜瓜枯萎菌、婁地青霉和蘋果炭疽菌的有效抑制性；具有良好的熱穩(wěn)定性，其發(fā)酵上清在經(jīng)過100℃處理后出現(xiàn)抑菌率顯著增大的結(jié)果；其發(fā)酵上清經(jīng)中性蛋白酶酶解處理后抑菌活性能得到提高；其發(fā)酵上清具有耐貯藏特性，在常溫貯藏20d后仍具有良好的抑菌活性。CGMCC No.965520140915
【IPC分類】A23L3-3571, A23C9-12, A01P3-00, A01P1-00, C12R1-25, A01N63-00, A23B7-155, C12N1-20, A23L1-29
【公開號】CN104818232
【申請?zhí)枴緾N201510232191
【發(fā)明人】陳永福, 張和平, 李常坤
【申請人】內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月8日