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      棉花GhEDR2基因及其編碼蛋白與應用

      文檔序號:8508975閱讀:645來源:國知局
      棉花GhEDR2基因及其編碼蛋白與應用
      【技術領域】
      [0001]本發(fā)明涉及植物基因克隆和功能分析,屬于植物基因工程領域,具體是一種棉花GhEDR2基因及其編碼蛋白與應用,其用于通過植物基因工程技術改善植物抗病性。
      【背景技術】
      [0002]棉花是在我國國民經濟中占有重要地位的經濟作物。棉花黃萎病是世界范圍內的病害之一,嚴重制約著棉花產業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展。近年來,棉花黃萎病的發(fā)生面積呈加重的趨勢,發(fā)病面積占棉花總面積的50%左右。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌侵染引起的真菌性維管束系統(tǒng)病害,屬于土傳病害。棉花黃萎病菌的寄主范圍非常廣泛,包括棉花、番茄、亞麻、馬鈴薯和茄子等兩百多種植物,就是在沒有合適寄主存在的惡劣條件下黃萎病菌也可以以微菌核在土壤中存活十年以上。目前各種棉花黃萎病防治措施,因此包括物理防治、化學防治、生物防治等方法很難對棉花起到防治效果,所以選育和利用抗黃萎病品種是解決這一難題最經濟有效的途徑。雖然我國在抗枯萎病育種方面已取得顯著成效,然而由于缺乏黃萎病抗源,棉花抗黃萎病育種的進展緩慢。
      [0003]EDR(Enhanced Disease Resistance) 2是從擬南芥edr突變體中克隆出的具有抗病性的基因。擬南芥EDR2包括一個PH區(qū),一個START區(qū)和一個DUF1336區(qū)。其中,pH區(qū)由主要負責與脂結合協(xié)助膜定位,START區(qū)在脂運輸和代謝以及細胞信號中起作用;DUF1336區(qū)是植物特有的結構域。EDR2的同源蛋白EDRl和EDR3在擬南芥中非常保守,它們介導的抗性都需要水楊酸(SA)的信號通路,而不需要茉莉酸(JA)和乙烯(ET),其介導的抗性具有廣譜性,在農業(yè)生產上具有重要的應用價值。
      [0004]隨著生物技術的發(fā)展,利用基因工程方法,將抗病基因直接導入棉花,創(chuàng)制抗黃萎病的種質材料,為我們提供了解決這一難題的有效方法。因此當今棉花抗病育種中,了解棉花的抗病機制和挖掘抗逆優(yōu)異基因資源,創(chuàng)制育種新材料已經成為當下棉花分子育種的主要任務??寺?、分離和研宄抗黃萎病相關的基因,分析不同基因的表達、調控機制為改良棉花品種提供物質基礎和理論依據。

      【發(fā)明內容】

      [0005]本發(fā)明為了彌補目前棉花品種在抗黃萎病方面存在的缺陷,提供了一種棉花GhEDR2基因及其編碼蛋白與應用。
      [0006]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:棉花GhEDR2基因,是如SEQ ID N0.1所示的堿基序列;或在SEQ ID N0.1所示的堿基序列基礎上進行一個或多個堿基的替換、缺失或/和插入的喊基序列變體,且該喊基序列變體所編碼的蛋白仍具有GhEDR2編碼蛋白的功能或活性。
      [0007]SEQ ID N0.1所示的堿基序列或者在嚴格條件下與其雜交且編碼得到的仍具有GhEDR2編碼蛋白的功能或活性的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述SEQ ID N0.1所示的堿基序列是利用NCBI數據庫中的基因序列,查找與擬南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段,將部分重疊且高度同源的棉花EST進行序列拼裝,組合成完整ORF的cDNA序列,根據這些序列設計特異性的PCR引物,采用RT-PCR的方法,獲得GhEDR2基因。
      [0008]本發(fā)明的目的之二是提供一種棉花GhEDR2基因編碼蛋白,是如(a)或(b)所示的蛋白:
      [0009](a) SEQ ID N0.2 所示的蛋白質;
      [0010](b)將SEQ ID N0.2所示的蛋白質通過一個或多個氨基酸的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhEDR2基因功能或活性的蛋白變體。
      [0011]SEQ ID N0.1是從棉花葉片中克隆出的棉花基因,命名為GhEDR2,開放閱讀框2449bp,編碼由816個氨基酸組成的蛋白質,如SEQ ID N0.2所示。
      [0012]另外,本發(fā)明提供了棉花GhEDR2基因在提高植物對黃萎病抗性中的應用。
      [0013]含有棉花GhEDR2基因的重組載體或重組菌或轉基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。
      [0014]進一步,含有棉花GhEDR2基因的重組載體是在pIPlOl的多克隆位點插入權利要求I所述的編碼基因得到的重組載體。
      [0015]本發(fā)明還提供了一種培育對黃萎病抗性的轉基因植物的方法,將含有棉花GhEDR2基因的導入到植物中,培育篩選得到對黃萎病抗性提高的轉基因植物。所述的植物為雙子葉植物和單子葉植物,如擬南芥、棉花和玉米。
      [0016]本發(fā)明根據同源基因序列的相對保守性,查找與擬南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段,將部分重疊且高度同源的棉花EST進行序列拼裝,組合成完整ORF的cDNA序列,根據這些序列設計特異性的PCR引物,采用RT-PCR的方法,獲得GhEDR2基因。利用qPCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在棉花植株中的表達呈現(xiàn)了組織特異性的特點。而且轉基因植物黃萎病的發(fā)病率明顯低于非轉基因植物。因此利用本發(fā)明所述的GhEDR2基因來培育抗黃萎病植物,在植物抗病育種中將會有廣闊的前景。
      【附圖說明】
      [0017]圖1為GhEDR2基因在棉花不同器官中的表達量分析。
      [0018]圖2為黃萎病病原菌處理棉花后不同時間GhEDR2基因表達。
      [0019]圖3為GhEDR2基因過量表達載體的構建。
      [0020]圖4為GhEDR2蛋白的亞細胞定位。
      [0021]圖5為轉GhEDR2基因擬南芥的PCR電泳圖。
      [0022]圖6為接種15天后轉GhEDR2基因擬南芥株系的病指調查,WT為野生型植株;PX1-PX5為的轉基因株系。
      [0023]圖7為接種20天后轉GhEDR2基因擬南芥株系的病指調查,WT為野生型植株;PX1-PX5為的轉基因株系。
      【具體實施方式】
      [0024]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明,但本發(fā)明并不限于以下實施例。
      [0025]下述所有基因操作方法均參照《分子克隆》(Sambrook J等人,1989)所述進行;有關試劑盒使用參照所購試劑盒的應用說明;所用限制性內切酶和其它工具酶均購自NEB公司。
      [0026]棉花材料為抗病棉花品種豫棉21,由山西省農業(yè)科學院棉花研宄所品種資源室提供。擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型、煙草品種為SR1,由中國科學院微生物所吳家和研宄員提供,根瘤農桿菌菌株GV3103本實驗室保存??寺≥d體pMD18-T Simple Vector、中間載體pDNOR、大腸桿菌DH5a、反轉錄試劑盒、Real time RT-PCR試劑盒、以及SYBR Premix ExTaq均購自TaKaRa公司,DNA純化試劑盒、質粒DNA快速抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工有限公司。所用引物合成及測序均由上海生工生物技術服務有限公司完成。
      [0027]一、棉花GhEDR2基因的克隆及序列分析
      [0028]1.總RNA的提取
      [0029]將棉花抗病品種豫棉21種植在花盆中,待棉花幼苗子葉完全伸展時,取棉花葉片按照TaKaRa公司RNA提取試劑盒說明提取總RNA。使用TaKaRa公司的PrimerScript?反轉錄酶進行cDNA合成。
      [0030]2.GhEDR2基因的分離
      [0031]根據同源基因序列的相對保守性,用擬南芥EDR2基因的堿基序列,用tblastn程序在GenBank的棉花ESTs數據庫中進行比對,將比對后的ESTs按照同源性高低進行排序,并選擇匹配分值高、E值低的序列。根據獲得的具有完整編碼區(qū)的同源基因序列,采用PrierPremier 5.0設計引物進行PCR擴增。
      [0032]GhEDR2 F GCTCACAATCAAAATCATAATCAA
      [0033]GhEDR2 R CAGGGAAGATGTGAAAAACG
      [0034]PCR擴增體系:反應總體積為40 ( μ L)的體系,模板2,Ρ1/Ρ2 2/2,DNTP3,BUFFER4,TAQ 0.4,水 26.6。PCR 反應條件為:95°C預變性 7min ;95°C變性 30s,52°C退火 30s,72°C延伸180s,變性、退火、延伸35個循環(huán)后,72°C再延伸10min,4°C保溫。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR產物的目的DNA條帶用干凈解剖刀從瓊脂糖膠中切下放在
      1.5mL的離心管中,然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的片段。純化回收完成后,取5yL進行電泳檢測。
      [0035]3.PCR產物的連接
      [0036]根據Takara pMD18_T Vector 的說明書,將回收的 GhEDR2 片段和 pMD18_T Vector于冰上融化后短暫離心,在1.5mL的離心管中建立如下反應體系:回收產物(GhEDR2片段)5yL,連接Mix 4.5yL, pMD18_T Vector 0.5 μ L,總體積10 μ L。所有產物加好后,用移液器輕輕混勻,16 °C過夜連接。
      [0037]4.連接產物的轉化
      [0038]_70°C冰箱中取出一管感受態(tài)細胞置于冰浴中,向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA5 μ L,輕輕旋轉離心管以混勻內容物,在冰浴中靜置30分鐘,將離心管置于42°C水浴中放置90秒,然后快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻2-3分鐘。向每個離心管中加入900 μ L無菌的LB培養(yǎng)基(不含抗生素),混勻后置于37 °C搖床震蕩培養(yǎng)45分鐘(150轉/分鐘),目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。將離心管內容物混勻,吸取100 μ L已轉化的感受態(tài)細胞加到75 μ MAmp+的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。再將平板置于室溫直至液體被吸收,倒置平板,37°C培養(yǎng)12-16小時。
      [0039]5.重組質粒的PCR鑒定
      [0040]分別挑選8個白斑接種到8個含有Amp+抗性的LB液體培養(yǎng)基的1.5mL的離心管中,置于37°C搖床震蕩培養(yǎng)5小時后,以這些菌液為模板進行PCR檢測,然后電泳檢測PCR產物,分別選取與目的片段大小一致的克隆測序,DNA測序由上海生工生物技術服務有限公司完成。
      [0041]二、棉花GhEDR2基因在不同組織及黃萎病誘導下基因的表達分析
      [0042]1.樣品的采集和處理設置
      [0043]將抗病棉花品種豫棉21種子脫絨后種植在花盆中,供試土壤為蛭石。子葉長出后定苗,每盆留苗3棵。培養(yǎng)條件為晝夜溫度分別為28°C、20°C,每天光照16h,黑暗8h,培養(yǎng)至兩周出現(xiàn)2片真葉完全展開時,進行黃萎病病原菌接種。采用蘸根法接種大麗輪枝菌V991,孢子濃度為1.0X107mL_1,分別于接種后12、24、36、48、72和96h取棉株幼根,同時取未接種黃萎病菌的棉株幼根作為對照,經液氮冷凍后,保存于一 80V冰箱。
      [0044]2.Quantitative Real-time RT-PCR 方法
      [0045]利用Quantitative Real-time RT_PCR(qRT_PCR)方法,檢測 GhEDR2 在棉花根、莖、葉中的表達情況及其黃萎病誘導后的不同時段的表達情況,GhEDR2擴增的一對引物為 GhEDR2-F:5,-ATGGTTTCAAGGGCAGGAT-3,;GhEDR2_R:5,-AATGCCAGGGAGGAAGGT-3,。以棉花ubiquitin基因(登錄號:AY189972)作為內標基因,擴增一對引物為Ub1-F
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