野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]苔蘚植物具有其他普通陸生植物無法比擬的植株體耐干特性。近年來，其耐干機制以及復水時強大的細胞保護和修復機制已成為抗逆分子生物學研宄的熱點。齒肋赤蘚廣泛分布于新疆古爾班通古特沙漠中，能適應沙漠中水分迅速變化，是沙漠生物結皮中的優(yōu)勢種。齒肋赤蘚在極端干燥狀態(tài)下，呈休眠狀態(tài)，似一層灰黑色的“殼”覆蓋在沙漠表面，一旦遇到降水，可在30s內迅速“復原”呈現(xiàn)鮮活的綠色，并能夠執(zhí)行光合作用。齒肋赤蘚具有強大的細胞保護及細胞修復機制，是不可多得的開展耐干機制研宄的實驗材料。
[0003]轉基因技術是研宄植物基因功能和規(guī)律非常有效的方法，特別是農(nóng)桿菌浸染法在植物轉化中被認為是最有效的轉基因方法之一。外源基因導入植物細胞體內的表達方式主要分為穩(wěn)定表達和瞬時表達兩種形式，其中，瞬時表達引入細胞的外源DNA與宿主的染色體DNA不發(fā)生整合，但這些DNA—般能隨載體進入細胞后12小時內可以表達，并能夠穩(wěn)定持續(xù)一定時間段。植物瞬時表達實驗方法簡單快速，表達量高且較為經(jīng)濟等優(yōu)點，在基因功能分析和重組蛋白等方面有廣泛的應用。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法是將復水后的野生齒肋赤蘚整株浸泡在改良的農(nóng)桿菌浸染液中，再經(jīng)過甘露醇水洗滌及無菌水沖洗后，用無菌濾紙將植株體表面水分吸干；將轉化后的外植體栽植于沙土中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)的外植體在不同時間段進行組織染色及實時RT-PCR分析，基因在齒肋赤蘚植物體中有一定表達。本發(fā)明所述方法可以從野生齒肋赤蘚外植體在1-15天內快速獲得大批量的轉基因植株，能夠進行快速外源基因表達分析，同時為齒肋赤蘚作為極具潛力的耐干旱機制研宄提供研宄方法依據(jù)。本發(fā)明所述方法簡單、快速、積極有效，獲得的轉基因植株表達效果好。
[0005]本發(fā)明所述的一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，其特征在于按下列步驟進行:
農(nóng)桿菌培養(yǎng):
a、采用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌:將農(nóng)桿菌加入到液體LB培養(yǎng)基中至菌液OD值達到0.6 ；
b、將步驟a中所得到的菌液再用液體LB培養(yǎng)基稀釋50倍，再將稀釋后的菌液搖菌至OD值為0.6，溫度保持在28 °C，3000rpm離心收集菌體5min ；
C、將步驟b 中收集的菌體，用 1/2 MS+0-200 μM AS+1-7%蔗糖+0.02% Tween20，ρΗ=5.6調整菌液濃度至0.2-1.0 ； d、將步驟c得到的菌液，用溫度24°C，轉速為120rpm的搖床搖菌2 h后，所得菌液用于侵染；
瞬時轉化:
e、將野生材料齒肋赤蘚植物苗浸泡在步驟d得到菌液中，在溫度24°C，轉速為100-120rpm的搖床上分別培養(yǎng)1，2，4，6 h，得到轉化苗；
f、將步驟e得到的轉化苗，用120mM的甘露醇水洗滌2-3次，用無菌水沖洗后，再用無菌濾紙將苗吸干水分，然后栽種到土壤中，培養(yǎng)ld，2d，3d，4d，5d，7d，15d ；
組織染色:
g、將步驟f栽培后的轉化苗一部分材料進行染色，檢測其基因的表達；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析基因表達量，最終繪出柱狀圖；
脫色:
h、將步驟g得到的染色的轉化苗，用濃度為95%的無水乙醇進行脫色即可。
[0006]本發(fā)明所述的一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法中所述的農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105是中國科學院新疆理化技術研宄所的肖向文老師與2012年5月贈送，是一種實驗室常用的農(nóng)桿菌菌株。
[0007]本發(fā)明所述的一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌，至菌液的OD值達到0.6 ;將所得到的菌液稀釋50倍，再將新鮮的LB菌液搖菌至OD值為0.6，3000rpm離心收集菌體5min，在搖菌過程中的溫度保持在28°C，二活后，菌液OD值達到0.6即達到實驗需求的濃度；然后收集的菌體，用1/2MS+0-200 μ M AS+1-7% 蔗糖 +0.02%Tween20，pH=5.6 調整菌液 OD 值至 0.2-1.0。在各種溶液濃度變化過程中，取一個變量，并且維持其他因素的最佳值保持不變，例如:當取AS濃度分別為0，5，75，100，125，150，200時，保持蔗糖濃度為3%，菌液OD值至0.8 ;當蔗糖濃度取1%，2%，3%，5%，7%時，保持AS濃度為100，菌液OD值至0.8 ;當調整菌液OD值至0.2,0.4，0.6，0.8，1.0時，保持AS濃度為100，蔗糖濃度為3%。
[0008]將得到的菌液，用溫度24°C，轉速為120 rpm的搖床搖菌2 h后，讓菌液適應性的菌液環(huán)境，所得菌液用于侵染；將野生材料齒肋赤蘚的植物苗浸泡在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌中進行處理，在處理植株苗過程中，需要將植株整株沉于溶液中，以便提高瞬時轉化效率；所得的處理苗在溫度24°C，轉速為100-120 rpm的搖床上分別培養(yǎng)1，2，4，6 h，得到轉化苗，再將得到的轉化苗用甘露醇水洗滌2-3次，用無菌水沖洗后，再用無菌濾紙將苗吸干水分；所述甘露醇的濃度為120 mM ;本方法利用高滲液的甘露醇對植物進行洗滌，能夠利用高滲壓加快外源DNA隨載體進入細胞的速度和效率；將得到的轉化后的外植體栽種到土壤中，培養(yǎng)ld，2d，3d，4d，5d，7d, 15d后，將一部分材料進行進行組織染色，檢測其基因的表達；另一部分留作分子材料，實時RT-PCR分析基因表達量測定，最終繪出柱狀圖；所得到染色的野生植物齒肋赤蘚植株體，用濃度為95%的無水乙醇進行脫色后，進行拍照。
[0009]本發(fā)明所述的野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法的流程為:農(nóng)桿菌的培養(yǎng)一一瞬時轉化一一組織染色一一脫色一一定性和定量分析轉化效率；
實驗原理:β-D-葡糖醛酸酶基因編碼)是從大腸桿菌K-12菌株分離出的一種酸性水解酶，能催化許多葡萄糖苷酯類物質的水解；其中組織化學法是催化的底物是X-gluc，產(chǎn)物為藍色化合物，該方法可觀察到外源基因在特定器官，組織，甚至單個細胞內的表達情況。
[0010]本發(fā)明所述的野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法中將得到的轉化苗，用120 mM的甘露醇水洗滌2-3次，用無菌水沖洗后，再用無菌濾紙將苗吸干水分，栽種到土壤中，培養(yǎng)ld，2d，3d，4d，5d，7d，15do其中，7d的栽培時間是指轉化苗在土壤中生長到第7天時，取樣，進行組織染色；15d的栽培時間是指轉化苗在土壤中生長到第15天時，取樣，進行組織染色。
[0011]本發(fā)明的本發(fā)明所述的一種野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚外源基因瞬時轉化方法，該方法適用于各種轉基因植物的快速瞬時轉化。對于植物瞬時表達實驗方法具有簡單快速，表達量高且較為經(jīng)濟等優(yōu)點。用該方法所得到的瞬時轉化植株體可以滿足植株在基因功能分析和重組蛋白等方面的應用。為進一步研宄野生極端耐干旱植物齒肋赤蘚的分子機制奠定了良好的基礎。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明染色圖，其中a為相同菌液濃度、不同浸染時間野生材料齒肋赤蘚的染色效果；b為相同浸染時間、不同菌液濃度野生材料齒肋赤蘚的染色效果；
圖2為本發(fā)明染色對比圖，其中a為未導入外源基因的野生材料齒肋赤蘚，即對照組CK，b為導入外源基因的野生材料齒肋赤蘚圖；c為浸染lOmin，轉化苗在土壤中栽培一天，AS濃度為100，蔗糖濃度為3%，菌液濃度OD值分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ;d為浸染30min，轉化苗在土壤中栽培一天，AS濃度為100，蔗糖濃度為3%，菌液濃度OD值分別為0.2，0.4，0.6，0.8, 1.0 ；e為轉化苗在土壤中栽培三天，AS濃度為100，菌液濃度OD值為0.8，蔗糖濃度分別為1%，2%，3%，5%，7% ；f為轉化苗在土壤中栽培三天，蔗糖濃度為3%，菌液濃度OD值為0.8，AS濃度為分別為O, 50，75，100，125，150，200 ；
圖3為本發(fā)明半定量RT-PCR檢測導入外源基因在野生材料齒肋赤蘚中的表達量圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合附圖對本發(fā)明做詳細說明:本實施例在本發(fā)明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和具體操作過程，但本發(fā)明所保護的范圍不限于下述實施例。
[0014]本實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到；
本實驗中，顯微鏡型號為:舜宇0D500C ;農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105是中國科學院新疆理化技術研宄所的肖向文老師與2012年5月贈送，是一種實驗室常用的農(nóng)桿菌菌株；
實施例1 農(nóng)桿菌培養(yǎng):
a、采用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌:將農(nóng)桿菌加入到液體LB培養(yǎng)基中至菌液OD值達到0.6 ；
b、將步驟a中所得到的菌液再用液體LB培養(yǎng)基稀釋50倍，再將稀釋后的菌液搖菌OD值至0.6，溫度保持在28°C，3000rpm離心收集菌體5min ； C、將步驟b中收集的菌體，用1/2MS+0 μΜ AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6調整菌液OD值至0.8 ；
d、將步驟c得到的菌液，用溫度24°C，轉速為120rpm的搖床搖菌2 h后，所得菌液用于侵染；
瞬時轉化: