r>[0043]優(yōu)選地，所述的步驟3)中，在線監(jiān)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)控制的細(xì)胞狀態(tài)指標(biāo)至少包括:細(xì)胞比生長速率，細(xì)胞周期分布，細(xì)胞周期平均停留時間。
[0044]優(yōu)選地，所述的步驟3)中，表達(dá)抗Her-2單克隆抗體的最適宜細(xì)胞狀態(tài)至少包括:細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞占35%?85%，S期細(xì)胞占15%?70%，G2/M期細(xì)胞占1%?40%且其總和為100%，細(xì)胞在G0/G1期平均停留時間I小時?80小時，S期平均停留時間2小時?40小時，G2/M期平均停留時間4小時?20小時。
[0045]優(yōu)選地，所述的步驟3)中，所述整個系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)的指標(biāo)主要是指乳酸生成速率，葡萄糖消耗速率比值，細(xì)胞比生長速率的值保持基本穩(wěn)定。
[0046]優(yōu)選地，所述的步驟3)中，自動監(jiān)控和記錄整個細(xì)胞培養(yǎng)和重組蛋白表達(dá)過程為:設(shè)定在線監(jiān)控系統(tǒng)自動記錄每個指標(biāo)探頭監(jiān)測數(shù)據(jù)和設(shè)備運行參數(shù)，自動記錄的時間間隔為5?300秒，并存儲數(shù)據(jù)。
[0047]優(yōu)選地，所述的步驟4)中，判斷生產(chǎn)完成的標(biāo)準(zhǔn)為:細(xì)胞活率下降，或細(xì)胞總數(shù)下降明顯，或蛋白表達(dá)明顯降低，可通過工藝放大前的預(yù)實驗結(jié)合整個系統(tǒng)的運行數(shù)據(jù)確定。
[0048]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0049]本發(fā)明提供的一種既可在線、連續(xù)、監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中多種理生化指標(biāo)，又可以直接調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)(包括細(xì)胞周期等)的生物反應(yīng)器類細(xì)胞培養(yǎng)裝置及由該裝置生產(chǎn)的方法，使抗Her-2單克隆抗體生產(chǎn)過程降低染菌風(fēng)險，維持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定，保持細(xì)胞恒定生長活力，達(dá)到高質(zhì)、高效連續(xù)生產(chǎn)抗Her-2單克隆抗體的目的。
【附圖說明】
[0050]圖1為細(xì)胞周期示意圖；
[0051]圖2為本發(fā)明實現(xiàn)可在線工業(yè)魯棒化(industrially robust)調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗Her-2單克隆抗體的裝置的一種實施方式的示意圖；
[0052]圖3為本發(fā)明實例I的細(xì)胞的初級培養(yǎng)和次級培養(yǎng)過程細(xì)胞生長動力學(xué)圖；
[0053]圖4為本發(fā)明實例I的細(xì)胞的初級培養(yǎng)和次級培養(yǎng)過程細(xì)胞周期分布柱狀圖；
[0054]圖5為本發(fā)明實例I的次級培養(yǎng)過程抗Her-2單克隆抗體表達(dá)圖。
【具體實施方式】
[0055]以上的描述大致說明了本發(fā)明的內(nèi)容，下面的幾個具體實施例將會更直接的體現(xiàn)本發(fā)明的情況，但必須指出的是，在此舉出的實例僅僅是為了加以說明的目的，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。以下實施例中用到的可在線調(diào)節(jié)和控制CHO細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗Her-2單克隆抗體的裝置參見圖2，其主要包括:培養(yǎng)液儲存罐、可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器、產(chǎn)品收獲罐(對應(yīng)圖中上清液收獲罐)、連接設(shè)置在可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器上的若干理生化指標(biāo)檢測器、在線監(jiān)控系統(tǒng)(對應(yīng)圖中在線監(jiān)控終端)、細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)(工作方式包括聯(lián)動方式一、聯(lián)動方式二和聯(lián)動方式三)、細(xì)胞截留裝置、若干流體無菌控速推動器和若干可控速管道體系，其中，所述培養(yǎng)液儲存罐通過所述可控速管道體系經(jīng)所述流體無菌控速推動器與所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器連接，所述細(xì)胞截留裝置連接所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器，所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)通過所述可控速管道體系經(jīng)所述流體無菌控速推動器選擇性與所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器或所述細(xì)胞截留裝置連接，所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)通過所述可控速管道體系經(jīng)所述流體無菌控速推動器連接所述產(chǎn)品收獲罐，所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器通過所述理生化指標(biāo)檢測器連接所述在線監(jiān)控系統(tǒng)，所述在線監(jiān)控系統(tǒng)與所述流體無菌控速推動器連接并發(fā)送控速指令給所述流體無菌控速推動器，上述所有容器類裝置均通過可控速管道體系進(jìn)行連接，其中，所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)用于所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)不同細(xì)胞比生長速率及不同細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控。需要說明的是本示意圖2的目的是幫助更好的理解本發(fā)明，而并非表明本發(fā)明的裝置與方法僅僅局限于此附圖所表現(xiàn)的形式。
[0056]其中，所述細(xì)胞截留裝置包括濃縮細(xì)胞出口和收獲細(xì)胞出口，所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)可擇一與所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器的罐體、所述細(xì)胞截留裝置的濃縮細(xì)胞出口或所述細(xì)胞截留裝置的收獲細(xì)胞出口相連接，所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)至少包括三種工作聯(lián)動方式，請結(jié)合圖2:
[0057]第一種(對應(yīng)圖2中聯(lián)動方式一)，當(dāng)所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)與所述細(xì)胞截留裝置的濃縮細(xì)胞出口相連接時，其可將所述細(xì)胞截留裝置中濃縮的細(xì)胞通過細(xì)胞截留裝置上的排廢細(xì)胞口排出，以達(dá)到所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)不同細(xì)胞比生長速率及不同細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控；
[0058]第二種(對應(yīng)圖2中聯(lián)動方式二)，當(dāng)所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)與所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器的罐體直接相連接時，其可將所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞通過所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器上的排廢口排出，以達(dá)到所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)不同細(xì)胞比生長速率及不同細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控；
[0059]第三種(對應(yīng)圖2中聯(lián)動方式三)，當(dāng)所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)與所述細(xì)胞截留裝置的收獲細(xì)胞出口相連接時，其可在所述細(xì)胞截留裝置的不同截留效率態(tài)時將不同濃度的細(xì)胞通過作為排廢細(xì)胞口的細(xì)胞截留裝置的收獲細(xì)胞出口排出，以達(dá)到所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器內(nèi)不同細(xì)胞比生長速率及不同細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控。
[0060]所述細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)控制裝置及聯(lián)動系統(tǒng)包括細(xì)胞分離回流單元和細(xì)胞排出單元及細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控系統(tǒng)，所述細(xì)胞分離回流單元可以為細(xì)胞回流口，其位于所述細(xì)胞截留裝置上，并可通過流體無菌控速推動器控制細(xì)胞回流速度；所述細(xì)胞排出單元可以為廢細(xì)胞排出口，其選擇性位于所述細(xì)胞截留裝置的濃縮細(xì)胞出口、收獲細(xì)胞出口或所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器的細(xì)胞排出口上；所述細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控系統(tǒng)將所述在線監(jiān)控系統(tǒng)的設(shè)定值反饋至所述細(xì)胞排出單元的流體無菌控速推動器，控制細(xì)胞排出的速度與排出的細(xì)胞量，當(dāng)排出的細(xì)胞量達(dá)到所述細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控系統(tǒng)給出的排出細(xì)胞量后，流體無菌控速推動器停止工作。
[0061]其中，具體在以下實施例中，培養(yǎng)液儲存罐為普通圓柱或方體瓶罐結(jié)構(gòu)，用以盛放無菌培養(yǎng)基，其出口與所述可控速管道體系密封連接，并且所述培養(yǎng)液儲存罐通過其罐體上設(shè)置的接口及所述接口上設(shè)置的無菌濾膜過濾器連通大氣。
[0062]可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器為普通商用細(xì)胞生物反應(yīng)器，具備多個理生化指標(biāo)探頭接口、多個液體進(jìn)出口和多個氣體進(jìn)出口，可在無菌條件下使用或更換不同數(shù)目的液體接口或氣體接口，以輸送不同液流或氣體進(jìn)入或離開所述可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器，并可選擇不同的理生化指標(biāo)探頭組。此外，可監(jiān)控細(xì)胞生物反應(yīng)器也可根據(jù)實際需要液體進(jìn)出口或氣體進(jìn)出口的數(shù)量設(shè)置為一個。此外也可以使用具備上述同樣功能的自制動物細(xì)胞生物反應(yīng)器。
[0063]理生化指標(biāo)檢測器均選自商用理生化指標(biāo)檢測器，如檢測電極，其具備信號轉(zhuǎn)換能力，能將理生化指標(biāo)傳感器檢測到的理生化指標(biāo)數(shù)值轉(zhuǎn)化為信號并傳輸至所述在線監(jiān)控系統(tǒng)，各理生化指標(biāo)檢測器均由電極導(dǎo)線與所述在線監(jiān)控系統(tǒng)連接，其中理生化指標(biāo)檢測器至少包括PH值、溫度、溶氧、溶CO2、滲透壓、細(xì)胞密度、葡萄糖、乳酸、氨指標(biāo)、液位檢測器的一種或幾種。此外也可以使用具備上述同樣功能的自制理生化指標(biāo)檢測器。
[0064]流體無菌控速推動器選自商品蠕動泵，能以設(shè)定的速率推動液體流動，可將流速信號傳輸至所述在線監(jiān)控系統(tǒng)，可通過手動或所述在線監(jiān)控系統(tǒng)自動調(diào)節(jié)工作功率以達(dá)到控制不同流速或停止流動的目的。此外也可以使用具備上述同樣功能的自制可控速流體推動器。
[0065]在線監(jiān)控系統(tǒng)選自商用控制塔，其具備接收所述理生化指標(biāo)傳感器傳輸?shù)男盘?、所述流體控速推動器傳輸?shù)男盘柕墓δ?，以及信號轉(zhuǎn)換處理功能，理生化指標(biāo)和流體控速推動器控制指令發(fā)出功能，數(shù)據(jù)記錄存儲功能，并具有完整的人機(jī)交互界面。此外也可以使用具備上述同樣功能的自制在線監(jiān)控系統(tǒng)。
[0066]可控速管道體系由符合重組蛋白生產(chǎn)需求的普通硅膠管組成管道體系本體并且任何兩容器類裝置之間的管道體系本體上都帶滑動控速夾或控速閥門，所述滑動控速夾或控速閥門設(shè)于相應(yīng)裝置出口處。此外，普通硅膠管還可以用高分子聚合膜材管來代替。
[0067]以下實施例中，使用上述裝置進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的在線工業(yè)魯棒化調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗Her-2單克隆抗體的方法，包含以下步驟:
[0068]I)對細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，然后向細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)通入無菌的PBS緩沖液或無菌培養(yǎng)液，循環(huán)清洗整個細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)；
[0069]2)向細(xì)胞培養(yǎng)裝置中接種細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞的初級培養(yǎng)；
[0070]3)當(dāng)細(xì)胞生長擴(kuò)增到適合表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞密度I?100X 16個細(xì)胞/ml和細(xì)胞活力70%以上時，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特性、細(xì)胞培養(yǎng)裝置的工作體積和在線監(jiān)控系統(tǒng)檢測的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)設(shè)定在線監(jiān)控系統(tǒng)的