專利名稱：調(diào)控調(diào)節(jié)性t細(xì)胞活性的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控與調(diào)控生物體內(nèi)免疫功能相關(guān)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的方法，特別涉及具有所述調(diào)控活性的組合物。
現(xiàn)有技術(shù)人具備排除外來異物的生物防御功能，同時(shí)耐受自身成分，通過B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、抗體和抗原呈遞細(xì)胞(APC)間的相互作用誘導(dǎo)和調(diào)控這些免疫應(yīng)答。首先，外來抗原經(jīng)APC加工，與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子和II類分子結(jié)合，呈遞給輔助性T細(xì)胞。輔助性T細(xì)胞識別與MHC分子結(jié)合的外來抗原，使T細(xì)胞活化，分泌細(xì)胞因子；有助于經(jīng)抗原刺激的B細(xì)胞向抗體產(chǎn)生細(xì)胞分化，同時(shí)也促進(jìn)殺傷性T細(xì)胞的分化。
通過分泌的抗體及活化的殺傷性T細(xì)胞排除抗原呈遞細(xì)胞，由此進(jìn)行排除外來抗原的細(xì)胞性、體液性免疫反應(yīng)。也就是說，T細(xì)胞起著核心作用，發(fā)動(dòng)識別靶抗原的免疫應(yīng)答。例如，人們很早就知道，在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。(L.Gross.Cancer Res.3326-333(1943)；L.Old等，Ann.N.Y.Acad.Sci.10180-106(1962)；R.J.North，Adv.Immunol.3589-155(1984)；P.D.Greenberg，Adv.Immunol.49281-355(1991)；D.M.Pardoll and S.L.Topalian，Curr.Opin.Immunol.10588-594(1998))。
CD8+CTL(細(xì)胞毒性T cell)是主要的效應(yīng)細(xì)胞，無論在體內(nèi)還是在體外均持有直接破壞腫瘤細(xì)胞的能力，但是它對呈遞給MHC I的抗原肽有嚴(yán)格的特異性，與此相反，自然殺傷性T(NKT)細(xì)胞受抗原特異性的制約相對較弱，它被認(rèn)為是固有性免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞(M.J.Smyth等，J.Exp.Med.191661-668(2000)；M.J.Smyth &D.I.Godfray.Nature Immunol.1459-460；M.J.Smyth等，Curr.Opin.Immunol.14165-171(2002)；T.Kawano等，Proc.natl.Acad.Sci.USA955690-5693(1998))。另一方面，CD4+T細(xì)胞不直接破壞腫瘤細(xì)胞，但發(fā)揮著通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應(yīng)答的基本作用(K.Huang等，J.Exp.Med.1882357-2368(1998)；F.Ossendorp等，J.Exp.Med.187693-702(1998)；D.M.Pardoll & S.L.Toplian，Curr.Opin.Immunol.10588-594(1998)；R..F.Wang，Trends.Immunol.5269-276(2001))。識別呈遞給MHC II分子的腫瘤抗原肽的CD4+輔助性T細(xì)胞通過與抗原呈遞細(xì)胞(APC)間的相互作用CTL的活化、增殖作用得以放大。與此相反，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)卻顯示出對抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答和各種自身免疫性疾病發(fā)展的有效性(E.M.Schvach，Annu.Rev.Immunol.18423-449(2000)；M.G.Roncarolo & M.K.Levings.Curr.Opin.Immunol.12676-683(2000)；J.Schimizu et al，J.Immunol.1635211-5218(1999)；S.Sakaguchi等Immunol.Rev.18218-32(2001))。但是，目前尚不清楚Treg所識別的自身抗原肽是什么、在抗原識別與功能上Treg與輔助性T細(xì)胞的差異和關(guān)系又如何(S.Sakaguchi，Nature Immunol.2283-284(2001)；K.J.Maloy & F.Powrie，Nature Immunol.2816-822(2001)；E.M.Shevach，Nature Rev.Immunol.6389-400(2002))。
在CTL的定量及定性擴(kuò)增中，輔助性T細(xì)胞、CTL及APC間連續(xù)的細(xì)胞間相互作用，提示與抗腫瘤免疫應(yīng)答相關(guān)的輔助性T細(xì)胞可能廣泛識別多種抗原(J.P.Ridge等，Nature 393474-478(1998)；S.R.M.Bennett等，Nature 393478-480(1998)；S.P.Schoenberger等，Nature 393480-483(1998)；Z.Lu等，J.Exp.Med.191541-550(2000))。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，通過將CTL識別抗原與SEREX(重組cDNA表達(dá)克隆抗原的血清學(xué)分析)抗原一起施用能極大地增強(qiáng)CTL活性、且能誘導(dǎo)強(qiáng)大的抗腫瘤能力(H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814571-14576(2001)；WO 03/000894 A1)。由此完成了與表達(dá)腫瘤特異性免疫的疫苗相關(guān)的發(fā)明(WO 03/000894 A1)，其中用包含CD4+輔助性抗原、優(yōu)選用SEREX法發(fā)現(xiàn)的分子，及CD8+CTL識別的抗原、優(yōu)選編碼腫瘤抗原的表達(dá)載體的組合物作為多核苷酸疫苗。
已經(jīng)闡明，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性細(xì)胞通常以功能成熟的狀態(tài)在正常的胸腺中產(chǎn)生，但其通常處于不反應(yīng)狀態(tài)，隨著T細(xì)胞受體(TCR)的刺激傳入其可強(qiáng)烈地抑制其它T細(xì)胞的活化、增殖，此過程中通過組成型表達(dá)的CTLA-4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4)分子和GITR(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子家族)分子介導(dǎo)的刺激傳遞對抑制能力的表達(dá)是必要的(T.Takahashi等，J.Exp.Med.192303-310(2000)；S.Read等，J.Exp.Med.192295-302(2000)；J.Shimizu等，Nature Immunol.3135-142(2002))。一般認(rèn)為Treg是由具有識別與MHC II結(jié)合的自身抗原的多種特異性的細(xì)胞構(gòu)成的，但對識別的抗原尚未進(jìn)行鑒定，對Treg抑制能力增強(qiáng)的機(jī)制也沒有完全搞清。
發(fā)明公開小鼠和人等正常個(gè)體具有作為針對外來異物的生物屏障的免疫系統(tǒng)，其不攻擊自己。一般認(rèn)為這種對自身的耐受是由自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞的排除、自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞的不活化及Treg造成的免疫抑制這3種機(jī)制形成的。一旦對自身的耐受受到破壞就會(huì)發(fā)生自身免疫性疾病，另一方面，這種自身耐受性允許癌細(xì)胞的增殖。另外，在臟器和組織移植中，外來抗原的排除機(jī)制給移植帶來困難。如今發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)中Treg對免疫抑制發(fā)揮重要作用后，人們殷切期望能開發(fā)出針對因免疫異常而引起的疾病，特別是自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)、過敏性疾病等的，調(diào)控Treg活性的方法和藥劑。
本發(fā)明者們在將編碼腫瘤抗原的表達(dá)載體和編碼SEREX抗原的表達(dá)載體施用給荷瘤小鼠觀察其抗腫瘤效果時(shí)，觀察到如果只施用編碼SEREX抗原的表達(dá)載體，可以觀察到對腫瘤組織的生長和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供包含CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別的抗原的組合物。另外，提供抑制哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，它包括將上述組合物施用給哺乳動(dòng)物。還提供預(yù)防和/或治療自身免疫性疾病的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動(dòng)物。還提供上述組合物在制備自身免疫性疾病的預(yù)防和/或治療劑中的應(yīng)用。
還提供過敏性疾病的預(yù)防和/或治療的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動(dòng)物；或提供上述組合物在制備預(yù)防和/或治療過敏性疾病的藥劑中的應(yīng)用。
還提供抑制器官或組織移植中排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)的方法，它包括將藥理上有效量的上述組合物施用給哺乳動(dòng)物；或提供上述組合物在制備抑制器官或組織移植中排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)的預(yù)防劑和/或治療劑中的應(yīng)用。
更詳細(xì)而言，用SEREX法發(fā)現(xiàn)的分子(SEREX抗原)使CD4+CD25+T細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)致敏，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，相反，用IFN-γ或同時(shí)施用IL-12和IL-18減弱活化了的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性，由此構(gòu)成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的調(diào)控方法。特別是，作為增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性的組合物，如包含編碼SEREX抗原的表達(dá)載體的多核苷酸，所述多核苷酸可單獨(dú)使用，也可以固定到載體顆粒上后施用到細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明的目的是，通過人為使用抗原使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞致敏，增強(qiáng)其免疫抑制活性，從而實(shí)現(xiàn)移植中排斥反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)的抑制、自身免疫性疾病的抑制及過敏性疾病的抑制，從而對患有這些疾病或具有所述病癥的患者提供有效的治療方法。
本發(fā)明涉及用于抑制免疫的方法，它基于這樣的發(fā)現(xiàn)通過施用編碼CD4+CD25+T細(xì)胞識別的抗原的表達(dá)載體，抑制免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明涉及包含CD4+CD25+T細(xì)胞識別的抗原或編碼該抗原的表達(dá)載體的組合物。詳細(xì)言之，CD4+CD25+T細(xì)胞所識別的抗原優(yōu)選用SEREX法發(fā)現(xiàn)的分子，該抗原可以是異種抗原，也可以是自身抗原，但優(yōu)選自身抗原。SEREX法是近年來由M.Pfreundschuh等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941914-1918(1997))開發(fā)的方法，是用人血清篩選人腫瘤cDNA表達(dá)文庫，在國際互聯(lián)網(wǎng)上，用SEREX法鑒定出的基因已經(jīng)超過1800種(www.licr.Org/SEREX.Html)，作為SEREX數(shù)據(jù)庫。它們包括但并不限定于，例如，熱休克蛋白DnaJ-like2(GenBank Accession No.NM_005494，XM_028966，XM_172161，XM_052862，XM_052754，XM_093388，NM_016306，NM_012328，NM_005880)、Galectin8(GenBank Accession No.AH008815，AF193806，AF193805)、PolyA結(jié)合蛋白[PolyA bindingprotein](GenBank Accession No.XM_0 67844)、連接酶[Ligase]1(GenBank Accession No.NM_000234)等。本說明書中的“SEREX鑒定分子”是指用SEREX法鑒定出的這些分子。
本發(fā)明中編碼抗原的多核苷酸，只要根據(jù)本發(fā)明的方法施用給宿主動(dòng)物能產(chǎn)生所期望的免疫應(yīng)答，無其他特殊限制，其可以是DNA或RNA。本發(fā)明的編碼抗原的多核苷酸，只要該多核苷酸編碼的多肽在宿主中可產(chǎn)生所期望的免疫應(yīng)答即可，其核苷酸序列可通過位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)方法等眾所周知的方法(參照Ausubel等，CurrentProtocols in Moleculor Biology(1987)John Wiley & Sons，Section 8.1-8.5)，人為造成一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸序列發(fā)生缺失、置換、插入、附加。另外，只要是在宿主動(dòng)物中可產(chǎn)生所期望的免疫應(yīng)答，可利用眾所周知的雜交技術(shù)(參照Ausubel等，Current Protocols in MoleculorBiology(1987)John Wiley & Sons，Section6.3-6.4)和基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)(參照Ausubel等，Current Protocols in MoleculorBiology(1987)John Wiley & Sons，Section6.1-6.4)分離自然界中存在的突變體。
另外，當(dāng)編碼抗原蛋白質(zhì)的基因已知時(shí)，可分析其蛋白質(zhì)氨基酸序列上的疏水性/親水性區(qū)域(Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.157105-122(1982))、進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析(Chou and Fasman，Ann.Rev.Biochem.47251-276(1978))、推算氨基酸序列中的抗原性區(qū)域(例如，參照Anal/Biochem.151540-546(1985)，然后合成推定的氨基酸序列的肽，用PEPSCAN法(Nature 314(1985)；特表昭60-500684號公報(bào))確定其抗原性，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易做到的。因此，通過化學(xué)合成等手段制備編碼包含根據(jù)上述方法確定的表位部分的肽片段的多核苷酸用作本發(fā)明的抗原的表達(dá)載體。
本發(fā)明中所應(yīng)用的表達(dá)載體是整合了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所識別的抗原基因的重組載體，作為插入抗原基因的載體可利用，例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、病毒及該領(lǐng)域中目前應(yīng)用的其它載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)，例如Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1987)John Wiley& Sons等記載的技術(shù)構(gòu)建各種質(zhì)粒和載體。
這里所用的啟動(dòng)子、終止子等在宿主內(nèi)發(fā)揮表達(dá)調(diào)控作用的因子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)宿主的種類和目的從眾所周知的調(diào)控序列中選擇，配置到抗原基因的上游和/或下游。因此，既可使用來自抗原的調(diào)控序列，也可使用異種調(diào)控序列。另外，根據(jù)需要本發(fā)明的表達(dá)載體中也可應(yīng)用抗生素耐性標(biāo)記等標(biāo)記。可利用多種商品化的載體，但本發(fā)明中優(yōu)選除去不必要的多核苷酸序列。
本發(fā)明的組合物可作為裸質(zhì)粒應(yīng)用，可包裝到脂質(zhì)體中，或構(gòu)建形成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、痘苗病毒載體、豆病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及HVJ載體等各種病毒載體(例如參照，K.Adolph“病毒基因組法”CRC Press，F(xiàn)lorida(1996))，或者包被到膠質(zhì)金等微珠(載體)上應(yīng)用。無限制但優(yōu)選將能表達(dá)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所識別抗原的載體附著在金粒等載體粒子上，通過基因槍等技術(shù)將其導(dǎo)入生物體內(nèi)。將多核苷酸包被載體粒子的技術(shù)眾所周知(例如，參照WO93/17706)。最終可將多核苷酸調(diào)整到適于生物體應(yīng)用的生理鹽水等溶液中。此外，也可并用幫助質(zhì)粒攝入到細(xì)胞內(nèi)的鈣離子等藥劑。需要時(shí)，也可與藥學(xué)上可接受的利于轉(zhuǎn)染的藥劑一起施用。
本發(fā)明的組合物可通過任一種方法施用，但優(yōu)選通過適當(dāng)?shù)姆墙?jīng)口途徑施用，例如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、脂肪組織內(nèi)、乳腺組織內(nèi)、吸入或肌肉內(nèi)注射、注入，或通過氣體誘導(dǎo)性粒子沖擊法(通過電子槍等)、點(diǎn)鼻藥等形式的通過粘膜途徑的方法施用。這些施用方法中，借助加速粒子的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，記載于美國專利第4945050號、第5240842號等中，市場上有售基于其改良方法的裝置(BioradLaboratories)。
本發(fā)明中對宿主動(dòng)物的種類沒有限定，具體而言，包括包含如小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬、羊、牛、馬及猴和人等靈長類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，其中更優(yōu)選人作宿主動(dòng)物。
發(fā)明的詳述本發(fā)明中所應(yīng)用的抗原或表達(dá)載體的施用量無限定，根據(jù)疾病的種類、程度、性別、年齡、體重、施用途徑而異，但是通常每次施用0.001μg-1g，優(yōu)選0.01μg-10mg，更優(yōu)選0.1μg-100μg。
如上所述的實(shí)施結(jié)果是造成免疫抑制狀態(tài)，該狀態(tài)可通過應(yīng)用IFN-γ或?qū)L-12和IL-18同時(shí)施用而解除。也就是說，通過適當(dāng)聯(lián)合這些細(xì)胞因子的作用和用SEREX抗原進(jìn)行致敏作用，可人為操縱調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可適用于自身免疫性疾病、器官移植反應(yīng)、過敏反應(yīng)及腫瘤免疫的調(diào)控等。
還可通過抗CD4抗體、抗CD25抗體的處理解除免疫抑制狀態(tài)。
因此，本發(fā)明提供調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的方法及組合物。
本發(fā)明通過明確SEREX抗原促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制活性，首次提出調(diào)控調(diào)節(jié)生T細(xì)胞活性的方法。
目前，盡管已開發(fā)出多種針對自身免疫性疾病和過敏反應(yīng)的治療以及針對抑制移植排斥反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)的治療的手段和藥劑，但其有效性有限，期望超越這些方法和藥劑的有效性。
近年來，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在生物體內(nèi)的重要性越來越明朗，本發(fā)明提供調(diào)控CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作用的極其有效的方法和組合物，給與自身免疫性疾病和過敏性疾病的治療、通過器官、組織移植的療法帶來很大的進(jìn)步。
附圖簡述

圖1表示單獨(dú)應(yīng)用SEREX抗原進(jìn)行免疫促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的圖。
圖2表示單獨(dú)應(yīng)用SEREX抗原進(jìn)行免疫誘導(dǎo)的促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的執(zhí)行細(xì)胞是CD4+細(xì)胞或CD4+CD25+細(xì)胞，而非CD8+細(xì)胞的圖。
圖3表示通過移植從單獨(dú)應(yīng)用SEREX抗原進(jìn)行免疫的小鼠中獲取的CD4+CD25+T細(xì)胞可促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的圖。
圖4表示單獨(dú)用SEREX抗原進(jìn)行前處理抑制mERK2抗原特異性的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。
圖中，9m-pulsed PIHTR是指mERK2 9m抗原蛋白質(zhì)，p63-71(T)-pulsed PIHTR是指對照的抗原蛋白質(zhì)。
圖5表示通過應(yīng)用mERK2或147HER2、Dna J-like2進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的對肺轉(zhuǎn)移的體內(nèi)預(yù)防和治療效果的圖表。
圖6、圖7、圖8和圖9是實(shí)施例4中小鼠背部腫瘤直徑的測定結(jié)果。
圖6表示用SEREX鑒定自身抗原Dna J-like2對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，對C57BL/6來源的黑色素瘤B16的排斥被耽擱，一部分小鼠因腫瘤死亡。
圖7表示用其它SEREX鑒定自身抗原對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫時(shí)與Dna J-like2進(jìn)行免疫時(shí)同樣，對C57BL/6來源的黑色素瘤B16的排斥被耽擱，一部分小鼠因腫瘤死亡。
圖8表示用Dna J-like2對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，通過施用抗CD25抗體可解除對C57BL/6來源的黑色素瘤B16排斥的延誤。
圖9表示用Dna J-like2對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，通過施用抗GITR抗體可解除對C57BL/6來源的黑色素瘤B16排斥的延誤。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但該實(shí)施例并沒有任何限定本發(fā)明的意圖。
參考例通過SEREX抗原和腫瘤抗原同時(shí)致敏，阻止肺轉(zhuǎn)移BALB/c起源的3-甲基膽蒽誘導(dǎo)的肉瘤CMS5m細(xì)胞，體內(nèi)注射后可引起肺轉(zhuǎn)移，5-6周內(nèi)使動(dòng)物致死。于是，用總量0.1ml 1×105CMS5m腫瘤細(xì)胞通過尾靜脈施用于BALB/c小鼠，作為肺轉(zhuǎn)移模型。用突變的激酶mERK2作為腫瘤抗原，用Dna J-like2作為SEREX抗原。在將下述物質(zhì)施用于腫瘤的14日前、7日前、當(dāng)天，或5日后開始進(jìn)行隔周免疫，所述的物質(zhì)是1)編碼mERK2的質(zhì)粒；2)編碼mERK2質(zhì)粒及對照載體的質(zhì)?；旌衔?；3)mERK2質(zhì)粒及Dna J-like2質(zhì)粒的混合物(根據(jù)H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9814571-14576(2001)記載的方法)。施用于腫瘤28天后殺死小鼠，用解剖顯微鏡數(shù)肺中小瘤數(shù)。各組用5只動(dòng)物，結(jié)果用均值±SEM表示。
通過在將所述物質(zhì)施用于腫瘤細(xì)胞之前14天，使用編碼的mERK2質(zhì)粒對小鼠進(jìn)行免疫，可以完全預(yù)防肺轉(zhuǎn)移。在將所述物質(zhì)施用于腫瘤細(xì)胞之前7天或在施用于腫瘤細(xì)胞之后進(jìn)行免疫時(shí)，看不到該預(yù)防效果(參見圖5)。與此相反，在配合施用mERK2質(zhì)粒以及Dna J-like2質(zhì)粒的免疫中，從將所述物質(zhì)施用于腫瘤細(xì)胞開始到施用5天之后的免疫中均可以完全預(yù)防轉(zhuǎn)移(參見圖5)。有無轉(zhuǎn)移可以通過組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。圖中的數(shù)值表示為各組5只小鼠的平均值±SEM。
實(shí)施例1 SEREX抗原單獨(dú)致敏促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移在與參考例同樣的肺轉(zhuǎn)移模型中，將所述物質(zhì)施用于腫瘤5日后，用編碼SEREX抗原的質(zhì)?；?qū)φ蛰d體進(jìn)行免疫，腫瘤接種28日后殺死被免疫的小鼠，數(shù)肺小瘤數(shù)。用熱休克蛋白質(zhì)Dna J-like2、DNA連接酶I、Galectin 8和poly A結(jié)合蛋白質(zhì)胞質(zhì)的4種(均為小鼠的蛋白質(zhì))作為SEREX抗原，用其各種質(zhì)粒進(jìn)行免疫時(shí)，小瘤數(shù)130-170，不進(jìn)行此種免疫時(shí)小瘤數(shù)為30-50。與此相反，用編碼即使反復(fù)進(jìn)行SEREX分析也未檢測出的3種小鼠分子、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、分泌型微管連接蛋白及含有TCP-1 zeta 1亞基(Cctz-1)侶伴蛋白的質(zhì)粒免疫時(shí)，未觀察到促進(jìn)轉(zhuǎn)移(圖1a、1b)。另外，用編碼3種人SEREX抗原(Homo sapiens HMBA誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、人視黃酸應(yīng)答蛋白質(zhì)和H.sapiens肝炎δ抗原反應(yīng)蛋白質(zhì)A)和卵清白蛋白等異種蛋白質(zhì)的質(zhì)粒免疫時(shí)未觀察到促進(jìn)轉(zhuǎn)移(圖1a)。也就是說，提示用作為自身抗原的SEREX抗原單獨(dú)致敏時(shí)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)移。
于是，分析了與促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞表型。用抗CD4單克隆抗體和抗CD25單克隆抗體對小鼠進(jìn)行前處理，全然沒有由Dna J-like2致敏造成的轉(zhuǎn)移促進(jìn)(圖2a、2b)。僅用抗CD25單克隆抗體進(jìn)行前處理時(shí)，與未進(jìn)行前處理的相比，轉(zhuǎn)移小瘤數(shù)大大減少(圖2b)。另外，用抗CD8單克隆抗體進(jìn)行前處理，用Dna J-like2致敏時(shí)，與未進(jìn)行抗體前處理時(shí)相比，可觀察到同等程度的轉(zhuǎn)移促進(jìn)(圖2c)。這些結(jié)果表示轉(zhuǎn)移的促進(jìn)由CD4+細(xì)胞或CD4+CD25+T細(xì)胞所承擔(dān)。
實(shí)施例2 用SEREX抗原致敏的CD4+CD25+T細(xì)胞促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移為了直接確認(rèn)實(shí)施例1中所得結(jié)果，將用SEREX抗原致敏的CD4+CD25+T細(xì)胞移植給腫瘤接種小鼠，觀察有無轉(zhuǎn)移的促進(jìn)。也就是說，將CD4+CD25+T細(xì)胞從用Dna J-like2抗原免疫的小鼠移植到荷瘤小鼠時(shí)，明顯促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移，但移植CD4+CD25-T細(xì)胞時(shí)幾乎沒觀察到肺轉(zhuǎn)移的促進(jìn)。另外，移植未致敏的CD4+CD25+T細(xì)胞時(shí)，與未移植時(shí)相比，可觀察到有意義的轉(zhuǎn)移促進(jìn)，但與移植致敏的CD4+CD25+T細(xì)胞相比轉(zhuǎn)移促進(jìn)要少很多(圖3)。
實(shí)施例3 用SEREX抗原進(jìn)行前處理，抑制CD4+T細(xì)胞的活性，而不抑制CD8+T細(xì)胞本發(fā)明者們先前曾報(bào)道過給腫瘤接種小鼠施用各種腫瘤抗原和編碼SEREX抗原的質(zhì)粒，引發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且在該過程中CD4+T細(xì)胞的輔助功能顯著增強(qiáng)，CD8+T細(xì)胞應(yīng)答性擴(kuò)增依賴于CD4+T細(xì)胞(H.Nishikawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814571-14576(2001)；WO 03/000894 A1)。
于是，對實(shí)施例2中確認(rèn)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的抑制中，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答是否有變化的問題進(jìn)行了研究。用突變的9-mer的激酶ERK2的肽(即mERK2 9m)作為腫瘤抗原。用DnaJ-like2先免疫小鼠，然后單獨(dú)用編碼mERK2 9m的質(zhì)?；蚴怪c編碼Dna J-like2的質(zhì)粒一起使用進(jìn)行免疫，通過ELISPOT分析mERK2 9m特異性的CD8+T細(xì)胞。單獨(dú)應(yīng)用mERK2 9m時(shí)，與DnaJ-like2先處理未造成CD8+T細(xì)胞變化(圖4a)，但一起使用時(shí)，在沒有進(jìn)行Dna J-like2沒處理時(shí)所觀察到的輔助活性增強(qiáng)，通過Dna J-like2的前處理而完全消失(圖4b)。這些結(jié)果表明，用SEREX抗原進(jìn)行免疫時(shí)，抑制CD4+T細(xì)胞的輔助活性，而不抑制CD8+T細(xì)胞的輔助活性。通過α-GalCer-CD1d四聚體分析可以看到局部自然殺傷性T(NKT)細(xì)胞的數(shù)量減少。
通過以上實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3可實(shí)驗(yàn)性證明，以小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中抗腫瘤免疫應(yīng)答為例，通過用編碼SEREX抗原的質(zhì)粒單獨(dú)處理，可活化CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，結(jié)果抑制CD4+T輔助細(xì)胞的活性，從而抑制整體的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例4 通過調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性而抑制同種免疫應(yīng)答本發(fā)明者用荷瘤小鼠的血清，通過SEREX法，鑒定出荷瘤個(gè)體的免疫系統(tǒng)識別的未發(fā)生突變的野生型自身抗原(SEREX鑒定自身抗原)。
由于SEREX鑒定自身抗原是由IgG識別的，所以可以認(rèn)為能被CD4細(xì)胞所識別。用ヘリオス型基因槍(Helios社Gene Gun)共免疫這些SEREX鑒定自身抗原和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識別的癌排斥抗原時(shí)，發(fā)揮強(qiáng)的輔助效果。
另一方面，用SEREX鑒定自身抗原單獨(dú)免疫時(shí)，在小鼠肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型中能見到腫瘤惡化，故認(rèn)為可對免疫進(jìn)行了抑制性調(diào)控。
認(rèn)為該機(jī)制由于用SEREX鑒定自身抗原單獨(dú)免疫時(shí)，活化CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，使NKT減少所致。本實(shí)施例中為了探討因SEREX鑒定自身抗原單獨(dú)免疫造成的免疫抑制效果與移植等同種免疫應(yīng)答有何種關(guān)系，給進(jìn)行SEREX鑒定自身抗原單獨(dú)免疫的小鼠接種其它系小鼠來源的腫瘤，探討對其增殖的影響。
(1)材料及方法小鼠使用BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠。
質(zhì)粒將SEREX鑒定自身抗原基因(DnaJ-like2、Mus DNALigase1(Ligase1)、Mus poly(A)結(jié)合蛋白，胞質(zhì)1(Poly A))整合到pBK-CMV質(zhì)粒中，包被到膠體金上。
基因?qū)?免疫)用ヘリオス型基因槍，以2周的間隔，單獨(dú)將SEREX鑒定自身抗原導(dǎo)入小鼠腹部皮內(nèi)進(jìn)行免疫。
腫瘤接種第2次單獨(dú)用SEREX鑒定自身抗原免疫1周后，將C57BL/6來源的黑色素瘤細(xì)胞株B16接種給BALB/c小鼠；將BALB/c來源的纖維肉瘤細(xì)胞株CMS5a接種給C57BL/6小鼠，分別接種1×106個(gè)細(xì)胞，接種到背部皮下。
接種腫瘤后，測定小鼠背部腫瘤的直徑隨時(shí)間變化的情況。(參照圖6-9)抗體抗CD25抗體是從雜交瘤PC61中經(jīng)過硫酸銨分級濃縮而成，施用0.25mg?？笹ITR(Glucocorticoid-induced TNF receptorsuperfamily 18)抗體是雜交瘤DTA-1(京都大學(xué)坂口志文教授提供)腹水8倍稀釋的產(chǎn)物，施用200μl(25μl)?？笴D4抗體是雜交瘤GK1.5腹水8倍稀釋的產(chǎn)物，施用200μl(25μl)。對于抗體施用，所有抗體均在腫瘤接種之前立即施用，只施用1次。
(2)結(jié)果與考察BALB/c小鼠中，由于用SEREX鑒定自身抗原進(jìn)行了免疫，C57BL/6小鼠來源的腫瘤排斥被耽誤，一部分小鼠因腫瘤死亡。
該現(xiàn)象可通過抗CD25抗體的施用、抗GITR抗體的施用而解除，所以可以認(rèn)為與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)。
通過由SEREX鑒定自身抗原的免疫而引起的對免疫應(yīng)答進(jìn)行抑制性調(diào)控的結(jié)果分析可以認(rèn)為同種免疫應(yīng)答也有所降低。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別的抗原是用SEREX方法鑒定的分子。
3.一種組合物，它包含編碼CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別的抗原的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別的抗原是用SEREX方法鑒定出分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的組合物，其中用SEREX方法鑒定出分子是自身抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、4和5中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中用SEREX方法鑒定出分子選自DnaJ-like2(GenBank Accession No.NM_005494，XM_028966，XM_172161，XM_052862，XM_062754，XM_093388，NM_016306，NM_012328，NM_005880)、Galectin8(GenBank Accession No.AH008815，AF193806，AF193805)、PolyA結(jié)合蛋白(GenBank Accession No.XM_067844)、連接酶1(GenBankAccession No.NM_000234)中的一種。
7.權(quán)利要求3-6中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中用基因槍施用該組合物。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的組合物，其用于預(yù)防和/或治療自身免疫性疾病。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的組合物，其用于預(yù)防和/或治療過敏性疾病。
10.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物，其用于抑制臟器或組織移植中排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)。
11.一種抑制哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的組合物。
12.一種調(diào)控哺乳動(dòng)物免疫的方法，它包括給哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)中的組合物，抑制哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，再施用IFN-γ恢復(fù)該哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
13.一種調(diào)控哺乳動(dòng)物免疫的方法，它包括對哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述組合物，抑制哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，再施用IL-12和IL-18恢復(fù)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
14.一種預(yù)防和/或治療自身免疫性疾病的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1的組合物。
15.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備預(yù)防和/或治療自身免疫性疾病的藥劑中的用途。
16.一種預(yù)防和/或治療過敏性疾病的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1的組合物。
17.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備預(yù)防和/或治療過敏性疾病的藥劑的中的用途。
18.一種抑制臟器或組織移植中的排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)的方法，該方法包括對哺乳動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的、如權(quán)利要求1所述的組合物。
19.權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的組合物在制備預(yù)防和/或治療抑制臟器或組織移植中的排斥反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)的藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的組合物以及調(diào)控方法。即涉及含有CD文檔編號A61K38/00GK1678338SQ0382037
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者珠玖洋 申請人:株式會(huì)社免疫新領(lǐng)域