一種降低總雙乙酰的啤酒酵母的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種降低總雙乙酰（TVDK)的啤酒酵母的選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 連二酮類物質(zhì)是啤酒中"生酒味"的主要來源，也是啤酒成熟的限制性指標(biāo)之一， 主要包括雙乙酰和戊二酮，其中以雙乙酰尤為重要。雙乙酰是揮發(fā)性的、有強(qiáng)烈刺激性的化 合物，它是多種香味物質(zhì)的前驅(qū)物，也是黃油、奶酪等乳制品的主要香味物質(zhì)。雙乙酰在啤 酒中的閾值在0. 1-0. 2mg/L之間，當(dāng)含量>0. 5mg/L時有類似餿米飯味的不愉快刺激味；當(dāng) 含量>0. 2mg/L時有似燒焦的麥芽味。優(yōu)秀淡爽型啤酒雙乙酰應(yīng)控制在0. 06mg/L以下。篩 選低產(chǎn)雙乙酰啤酒酵母不僅可以在啤酒發(fā)酵的主酵部分有效降低雙乙酰含量，也為啤酒后 酵部分雙乙酰的快速還原奠定了良好基礎(chǔ)。因此，采用簡單有效、適用性強(qiáng)的篩選低產(chǎn)雙乙 酰啤酒酵母方法，將會為啤酒產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)啤酒帶來事半功倍的效果。
[0003] 雙乙酰是酵母合成纈氨酸等含氮物質(zhì)的旁路產(chǎn)物，其前驅(qū)物a -乙酰乳酸在積累 過量時會通過非酶氧化分解反應(yīng)直接生成雙乙酰。灌裝后的成品啤酒中殘留的a-乙酰 乳酸，會在一定條件下反應(yīng)生成雙乙酰，造成雙乙酰"反彈"的現(xiàn)象，影響成品啤酒風(fēng)味。研 宄表明，向發(fā)酵液中添加過量纈氨酸會反饋抑制a-乙酰乳酸合成纈氨酸的代謝途徑，從 而減少a-乙酰乳酸的生成，使啤酒中雙乙酰含量降低。減少雙乙酰含量報道有很多，但在 啤酒工業(yè)化生產(chǎn)過程中大量添加氨基酸或相關(guān)酶類成本過高，也會對啤酒的風(fēng)味產(chǎn)生一定 影響；通過基因重組得到纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型酵母菌株的方法雖能有效降 低雙乙酰含量，但考慮到食品安全問題，目前鮮有工廠采用該法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。D-Val是 L-結(jié)I氨酸（）的旋光異構(gòu)體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定濃度的D-Val對酵母生長代謝具有一定抑制作 用。篩選對D-Val敏感的酵母菌株，能有效降低啤酒發(fā)酵中a-乙酰乳酸的積累，從而減少 的雙乙酰生成并解決雙乙酰"反彈"的現(xiàn)象。
[0004] 雙乙酰是由啤酒酵母胞內(nèi)合成分泌到胞外的乙酰乳酸緩慢氧化脫羧形成的非酶 反應(yīng)，因此降低雙乙酰含量另一途徑即加快雙乙酰的還原速度。根據(jù)雙乙酰的形成、還原機(jī) 理，通過保持環(huán)境中雙乙酰含量的高濃度(高于原菌株發(fā)酵產(chǎn)物10倍以上)，促使與啤酒酵 母雙乙酰還原相關(guān)酶系超量表達(dá)，得到雙乙酰還原速度快的啤酒酵母菌株。
[0005] 本方法所建立的降低TVDK的啤酒酵母選育方法，其優(yōu)勢在于能篩選出既含有低 雙乙酰前驅(qū)物的又能快速還原雙乙酰的啤酒酵母菌株，在降低雙乙酰含量的同時克服了雙 乙酰"反彈"的問題，對優(yōu)質(zhì)啤酒的研發(fā)與生產(chǎn)具有很強(qiáng)的理論和實(shí)踐意義。本發(fā)明對TVDK 含量進(jìn)行整體檢測，比直接檢測雙乙酰含量更加準(zhǔn)確可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要根據(jù)酵母a _乙酰乳酸生成雙乙酰和纈氨酸的代謝途徑，該法綜合運(yùn) 用過量雙乙酰及D-纈氨酸（D-Val)對酵母生長代謝的抑制作用。先將出發(fā)菌株發(fā)酵液在 基礎(chǔ)麥汁瓊脂培養(yǎng)基上生長，然后將單菌落依次點(diǎn)接于含有適量D-Val和過量雙乙酰的麥 汁瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，通過比較與發(fā)酵試驗(yàn)，得到低TVDK啤酒酵母菌株。通過 發(fā)酵試驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)菌株雙乙酰含量，計算其雙乙酰降低率及正突變率，以此評價該法的有 效性。
[0007] 技術(shù)方案 本發(fā)明主要根據(jù)酵母a-乙酰乳酸直接生成雙乙酰和間接生成纈氨酸的代謝途徑，利 用D-Val對酵母生長代謝的抑制作用，選取含適當(dāng)濃度D-Val麥汁瓊脂培養(yǎng)基，篩選D-Val 敏感菌株，該菌株具備低雙乙酰前驅(qū)物的優(yōu)勢。選取含過量雙乙酰的麥汁瓊脂培養(yǎng)基，篩選 耐高濃雙乙酰的菌株，該菌株具備快速還原雙乙酰的能力。
[0008] 本發(fā)明通過利用無菌牙簽點(diǎn)接，將低雙乙酰前驅(qū)物和快速還原雙乙酰兩種方法合 二為一，以降低啤酒酵母TVDK含量，并通過比較實(shí)驗(yàn)菌株雙乙酰降低率及正突變率驗(yàn)證該 法的有效性。
[0009] 本發(fā)明的具體操作方法： 1) 將出發(fā)菌株發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)濃度涂布于麥汁瓊脂平板中，28°C恒溫培養(yǎng)24h ; 2) 分離并保藏單菌落，用無菌牙簽將其分別依次點(diǎn)接入含有500mg/L D-Val (A培養(yǎng) 基）及50mg/L雙乙酰（B培養(yǎng)基）的麥汁瓊脂平板中，28°C恒溫培養(yǎng)3-4d ; 3) 每隔24h觀察菌落生長情況，對D-Val敏感的菌株具有雙乙酰前體物含量低的特點(diǎn)， 而耐高濃度雙乙酰的菌株具有快速還原雙乙酰的特性。因此，挑選在A培養(yǎng)基上生長緩慢 且在B培養(yǎng)基上生長良好的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)； 4) 發(fā)酵結(jié)束后，將過濾后的發(fā)酵液及啤酒標(biāo)樣于60°C下水浴90min，然后置于20°C水 浴鍋中冷卻，參照《啤酒分析方法》GB/T4928-2008蒸餾雙乙酰并利用鄰苯二胺一分光光度 法檢測樣品及對照吸光值，計算得到實(shí)驗(yàn)菌株TVDK含量。TVDK計算公式如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降低總雙己酷（TVDK)的啤酒酵母選育方法，包括W下步驟： 1) 將出發(fā)菌株發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)濃度涂布于麥汁瓊脂平板中，28°C恒溫培養(yǎng)2化； 2) 分離并保藏單菌落，用無菌牙簽將其分別依次點(diǎn)接入含有500mg/LD-Val(A培養(yǎng)基） 及50mg/L雙己酷（B培養(yǎng)基）的麥汁瓊脂平板中，28°C恒溫培養(yǎng)3-4d; 3) 每隔2化觀察菌落生長情況，對D-Val敏感的菌株具有雙己酷前體物含量低的特點(diǎn)， 而耐高濃度雙己酷的菌株具有快速還原雙己酷的特性，因此，挑選在A培養(yǎng)基上生長緩慢 且在B培養(yǎng)基上生長良好的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)； 4) 發(fā)酵結(jié)束后，將過濾后的發(fā)酵液及啤酒標(biāo)樣于60°C下水浴90min，然后置于20°C水 浴鍋中冷卻，參照《啤酒分析方法》GB/T4928-2008蒸饋雙己酷并利用鄰苯二胺一分光光度 法檢測樣品及對照吸光值，計算得到實(shí)驗(yàn)菌株TVDK含量，TVDK計算公式如下： 式中：
TVDK--樣品的總雙己酷含量，單位為暈克每升（mg/L); A335--樣品在波長335皿下，用10mm石英比色皿測得的樣品檢驗(yàn)的吸光度； Abi-一蒸饋水在波長335nm下，用10mm石英比色皿測得的空白檢驗(yàn)的吸光度； Kt--1%雙己酷標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長335皿下，用lOmm石英比色皿測得的校準(zhǔn)的吸光度； 0. 625--標(biāo)準(zhǔn)品中雙己酷含量，單位為暈克每升（mg/L)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于一種降低總雙乙酰（TVDK）的啤酒酵母選育方法。該法綜合運(yùn)用過量雙乙酰及D-纈氨酸（D-Val）對酵母生長代謝的抑制作用。先將出發(fā)菌株發(fā)酵液在基礎(chǔ)麥汁瓊脂培養(yǎng)基上生長，然后將單菌落依次點(diǎn)接于含有適量D-Val和過量雙乙酰的麥汁瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，通過比較與發(fā)酵試驗(yàn)，得到低TVDK啤酒酵母菌株。檢測實(shí)驗(yàn)菌株TVDK含量，其正突變率可達(dá)到73.33%，降低率最高值為57.62%。該方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，對啤酒企業(yè)克服雙乙?！胺磸棥?，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)啤酒具有很強(qiáng)的理論和實(shí)踐意義。
【IPC分類】C12R1-865, C12N1-18
【公開號】CN104845895
【申請?zhí)枴緾N201510265754
【發(fā)明人】李紅, 加布里·埃法卡斯, 坤·西拉德, 金瑋鋆, 貝爾特·唯客思日-赫琦, 蘇珊娜克思
【申請人】中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月24日