一種試劑盒及其應(yīng)用、檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域，特別涉及一種試劑盒及其應(yīng)用、檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阪崎克羅諾桿菌是一種具有周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢，兼性厭氧的革蘭氏陰性桿 菌，可引起嬰幼兒死亡，尤其是對(duì)早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大， 嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎，報(bào)告病例的病死率達(dá)20%~50%，幸 存者常有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。流行病學(xué)研宄顯示，受污染的嬰兒配方奶粉是引發(fā)嬰兒、 早產(chǎn)兒感染阪崎克羅諾桿菌的主要渠道。
[0003] 目前嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)方法主要通過培養(yǎng)法分離、鑒定，整 個(gè)過程操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，陽性率低。實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有敏感性、特異性和穩(wěn)定性特性， 可很好的彌補(bǔ)上述不足，現(xiàn)已在嬰兒配方奶粉生產(chǎn)企業(yè)廣泛應(yīng)用。但阪崎克羅諾桿菌在嬰 兒配方奶粉生產(chǎn)過程中經(jīng)過巴氏殺菌后多數(shù)已經(jīng)死亡，由于DNA在死菌中能保留很長(zhǎng)時(shí) 間，而傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法無法區(qū)別死菌和活菌，干擾了檢測(cè)的真實(shí)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種試劑盒及其應(yīng)用、檢測(cè)方法。本發(fā)明提供一種檢測(cè)配方 奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EM實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)嬰兒配方奶 粉中活的阪崎克羅諾桿菌快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括引物組；所述引物組包括具有如SEQ ID No. 1所示 的上游引物和具有如SEQ ID No. 2所示的下游引物。
[0007] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，試劑盒還包括熒光探針。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，試劑盒中所述熒光探針具有如Y -FAM-SEQ ID No. 3-MGB-3'所不的序列。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，試劑盒還包括疊氮溴乙錠。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，試劑盒還包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混 合物和DNA聚合酶中的一種或兩者以上的混合物。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒在檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng)用。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述試劑盒在檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌中的應(yīng) 用中所述活的阪崎克羅諾桿菌為嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌。
[0013] 本發(fā)明還提供了基于所述試劑盒的檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌的方法，取待測(cè)樣品 經(jīng)預(yù)處理后，提取核酸，擴(kuò)增，CT值小于30,檢測(cè)結(jié)果為陽性。
[0014] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，基于所述試劑盒的檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中所述活的阪崎克羅諾桿菌為嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌。
[0015] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，基于所述試劑盒的檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中所述預(yù)處理為所述待測(cè)樣品經(jīng)疊氮溴乙錠處理。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，基于所述試劑盒的檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中，總反應(yīng)體系25 μ L，包括2 XPremix Ex Taq ? 12. 5 μ L，上、下游引物（20 μ mol/L) 各 0· 3 μ L，探針（20 μ mol/L) 0· 3 μ L，ROX 0· 2 μ L，模板 DNA 各為 5· 0 μ L，用 ddH20 補(bǔ)足。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，基于所述試劑盒的檢測(cè)活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中，反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 2min，變性95°C 30s，退火60°C 3〇8,40個(gè)循環(huán)。在60°〇處 設(shè)定熒光檢測(cè)點(diǎn)。熒光檢測(cè)模式選擇FAM熒光，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以 閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線。
[0018] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：提供了嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EM實(shí) 時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物和熒光探針、EM試劑、PCR緩沖 液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下：
[0019] 上游引物：5' -gca caa gcg gtg gag cat-3'
[0020] 下游引物：5' -aac cca aca ttt cac aac acg ag_3'
[0021] 焚光探針：5' -FAM-ctt acc tgg tct tga cat c-MGB-3'
[0022] 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。
[0023] 本發(fā)明關(guān)鍵在于樣品EMA前處理，特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計(jì)及檢測(cè)方 法，PCR試劑盒中其他組成，可按本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，該試劑盒可用作嬰兒配方奶粉中活 的阪崎克羅諾桿菌的定性檢測(cè)，也可加入標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0024] 以梯度濃度的活阪崎克羅諾桿菌DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進(jìn)行EM實(shí)時(shí) 熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以活的阪崎克羅諾桿菌濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品測(cè)得的Ct值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得嬰兒配方奶粉中活阪崎克羅諾桿菌的 濃度。
[0025] 本發(fā)明還涉及檢測(cè)嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EMA實(shí)時(shí)熒光PCR的檢 測(cè)方法，所述方法如下：
[0026] (1)樣品EMA前處理：取樣品lg，加無菌生理鹽水9ml，充分溶解后，
[0027] 3000r/min，lOmin，去上清。加無菌生理鹽水180 μ 1，溶解后移至I. 5mleppendorf 管，加入EMA使其終濃度為30 μ g/ml。在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理 5min，光源放在離樣品管20cm處，光照時(shí)EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。同條件重復(fù) 進(jìn)行黑暗處放置、光照處理3次后，用生理鹽水沉淀3次。
[0028] (2)核酸提?。簩⑸鲜龀恋砦?，用200 μ 1無菌蒸餾水溶解，置沸水浴lOmin， 1000 Orpm離心5min，吸上清至另一離心管，-40°C保存?zhèn)溆茫?br>[0029] (3)總反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系25 μ L，包括2 X Premix Ex Taq ? 12. 5 μ L，上、下游 引物（20 μ mol/L)各 0· 3 μ L，探針（20 μ mol/L) 0· 3 μ L，ROX 0· 2 μ L，模板 DNA 各為 5. 0 μ L， 用ddH20補(bǔ)足。
[0030] (4)所述特異性引物和熒光探針序列如下：
[0031] 上游引物：5' -gca caa gcg gtg gag cat-3'
[0032] 下游引物：5' -aac cca aca ttt cac aac acg ag_3'
[0033] 焚光探針：5' -FAM-ctt acc tgg tct tga cat c-MGB-3'
[0034] 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB為熒光淬滅基團(tuán)。
[0035] (5)反應(yīng)條件：預(yù)變性95°C 2min，變性95°C 30s，退火60°C 30s，40個(gè)循環(huán)。在 60°C處設(shè)定熒光檢測(cè)點(diǎn)。熒光檢測(cè)模式選擇FAM熒光，基線調(diào)整取3~15個(gè)循環(huán)的熒光信 號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測(cè)樣品熒光增長(zhǎng)曲線超過 閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，CT值小于30,則判斷為陽性，即樣本中存在活的阪崎克羅諾 桿菌。
[0036] 本發(fā)明建立了利用EM熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿 菌的方法，并經(jīng)檢測(cè)模擬雙盲阪崎克羅諾桿菌污染嬰兒配方奶粉樣本，對(duì)死菌DNA去除率、 敏感性、特異性試驗(yàn)表明該方法切實(shí)可行。因?yàn)楸痉椒ú捎昧?EM對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行前處理， 避免了由于常規(guī)PCR擴(kuò)增死菌或殘留DNA引起的假陽性率，使得其特異性亦大大提高。而 且由于采用了 TaqMan-MGB探針的熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)，使得細(xì)菌的檢測(cè)敏感性、特異性大大 提尚。
[0037] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：EMA的應(yīng)用，避免了由于常規(guī)PCR擴(kuò)增死菌或殘留 DNA引起的假陽性率，使得其特異性亦大大提高?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)配方奶粉加工過程中活的阪崎克 羅諾桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)。
[0038] 本發(fā)明應(yīng)用疊氮溴乙錠（Ethidiummonoazide bromide，EMA)能穿過死細(xì)菌的細(xì)胞 膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價(jià)結(jié)合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增的特性，將EM與PCR技術(shù)結(jié)合，建立了活的阪崎克羅諾桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法，為嬰兒 配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌快速、準(zhǔn)確、特異檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。
【附圖說明】
[0039] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0040] 圖1示不同濃度阪崎克羅諾桿菌EM實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中圖1(A)、圖 I (B)為分別取濃度為 5. 5 X 107cfu/ml，5. 5 X 106cfu/ml，5. 5 X 105cfu/ml，5. 5 X IO4Cfu/ ml，5· 5 X 103cfu/ml，5· 5 X 102cfu/ml，5· 5 X 10cfu/ml 7 種濃度阪崎克羅諾桿菌菌培養(yǎng) 物進(jìn)行EM實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果，Ct值與待檢菌濃度對(duì)數(shù)具有良好線性關(guān)系，Ct = 34. 67-3. 13 X log (菌濃度），相關(guān)系數(shù)（r)為0. 998 ;方法的最低檢測(cè)濃度達(dá)到55cfu/ml ; 橫坐標(biāo)代表循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度；
[0041] 圖2示EMA熒光定量PCR技術(shù)特異性結(jié)果；橫坐標(biāo)代