一種具有生物活性的溫敏性水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有生物活性的溫敏性水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]長期以來，臨床上對周圍神經(jīng)損傷的修復仍不理想，對粗大、長段神經(jīng)缺損和多發(fā)性神經(jīng)損傷更是無計可施。人們一直都在探索并尋找能夠有效取代自體移植神經(jīng)的橋接物，隨著組織工程學和神經(jīng)科學的發(fā)展，應用組織工程學原理制備神經(jīng)組織移植物，以其代替自體神經(jīng)橋接長節(jié)段受損神經(jīng)獲得較好療效，因此神經(jīng)組織工程移植物受到越來越多的關(guān)注，有望利用組織工程學解決神經(jīng)組織修復的難題。近幾年來，人們逐漸認識到基體材料在組織工程中占有重要地位，隨著對材料與生物體相互作用機理研宄的深入，要求基體材料具有生物活性，可誘導宿主的有利反應，比如可以誘導宿主組織的再生等。
[0003]水凝膠是一種能夠在水中溶脹同時材料內(nèi)部保留大量水分而又不會溶解在水中的高分子材料，一般呈電中性或離子性，它由交聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與介質(zhì)組成多元體系，其力學性能與軟組織相似，作為一種軟材料，無固定幾何形狀，內(nèi)部三維多孔結(jié)構(gòu)，因而不會引發(fā)機體強烈的免疫排斥反應并減少免疫因子及免疫細胞的不利影響。使用水凝膠作為神經(jīng)組織工程支架材料具有如下優(yōu)點:(I)水凝膠內(nèi)部含有大量的水，有助于凝膠內(nèi)部與外部環(huán)境進行有效的物質(zhì)交換，維持組織微環(huán)境的平衡；(2)多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞粘附以及細胞長入到支架內(nèi)部；(3)可被促細胞粘附多肽和促細胞生長的細胞外基質(zhì)修飾，可作為生物活性分子的載體，進而促進細胞粘附和組織生長；(4)生物相容性良好，組織刺激性較低；(5)能夠有效的促進細胞迀移和軸突生長；(6) —般具有生物降解性，可避免組織再生后二次手術(shù)取出；(7)可原位凝膠化或通過注射填充任意形狀的空腔。
[0004]然而目前人工合成高分子水凝膠的最大缺點就是缺乏生物活性，不利于神經(jīng)細胞選擇性吸附和激活一些特異基因，因此需要將合成高分子水凝膠進行生物活性修飾，基于神經(jīng)細胞外基質(zhì)材料的仿生設(shè)計，利用材料的多組分復合技術(shù)，將一些具有生物活性的分子引入到合成高分子水凝膠的表面，以期改變合成高分子水凝膠對神經(jīng)細胞的選擇性吸附以及促神經(jīng)軸突生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種具有生物活性的溫敏性水凝膠及其制備方法，以末端接有鏈轉(zhuǎn)移活性基團的PNIPAM-b- (PEG-g-1KVAV)作為前驅(qū)體，以Ac-PEG-Ac作為大分子交聯(lián)劑，以BISAM作為小分子交聯(lián)劑，通過引發(fā)劑引發(fā)活性自由基聚合制備一種具有生物活性的溫敏性水凝膠，該水凝膠可用作促進神經(jīng)細胞粘附和增殖的水凝膠支架材料。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0007]提供一種具有生物活性的溫敏性水凝膠，它由以下方法制備得到:
[0008]I)制備HO-PEG-COOH:將聚乙二醇(PEG)溶于四氫呋喃中，得到濃度為0.01?0.07g/mL的聚乙二醇溶液，向聚乙二醇溶液中加入CaH2，室溫下充分攪拌均勻后加入溴乙酸乙酯，其中聚乙二醇、0&!12與溴乙酸乙酯摩爾比為1:0.85:1.7，充分攪拌后過濾，向濾液中加入正己烷，過濾出所得沉淀物，將沉淀物真空干燥后溶于水，得到濃度為0.2?0.6g/mL的水溶液，向所述水溶液中加入NaOH水溶液，使聚乙二醇與NaOH摩爾比為1:1.7，充分攪拌后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至12.5，加入二氯甲烷進行初次萃取，取水相并將pH值調(diào)至3，再向水相中加入二氯甲烷進行二次萃取，取有機相并加入正己烷，分離得到H0-PEG-C00H ；
[0009]2)制備Ac-PEG-COOH:將步驟I)所得H0-PEG-C00H溶解于四氫呋喃中得到濃度為0.01?0.lg/mL的H0-PEG-C00H溶液，并加入丙烯酰氯和三乙胺，使H0-PEG-C00H與丙烯酰氯、三乙胺摩爾比為1:2.3:2.5，室溫反應3?6小時后過濾，向所得濾液中加入正己烷，沉淀物分離、干燥得到Ac-PEG-COOH ；
[0010]3)制備Ac-PEG-Ac:將聚乙二醇溶解于四氫呋喃中，得到濃度為0.01?0.07g/mL的聚乙二醇溶液，向聚乙二醇溶液中加入丙烯酰氯和三乙胺，使聚乙二醇與丙烯酰氯、三乙胺的摩爾比為1:3:3.5，室溫反應I?4小時后過濾，向所得濾液中加入正己燒，沉淀物分尚、干燥得到Ac-PEG-Ac ；
[0011]4)制備Ac-PEG-g-1KVAV:將步驟2)制備的Ac-PEG-COOH溶解于四氫呋喃中，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，使Ac-PEG-COOH與二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:2.5:2.5，活化0.5?2小時后加入IKVAV多肽和N, N-二異丙基乙胺(DIPEA)，其中Ac-PEG-COOH與IKVAV多肽、N，N-二異丙基乙胺的摩爾比為1: 1.5:1.5，室溫下反應2?6h后加入正己烷，沉淀物分離、干燥得到Ac-PEG-g-1KVAV ；
[0012]5)制備PNIPAM-b-PEG-g-1KVAV前驅(qū)體:以N-異丙基丙烯酰胺為反應單體，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯為RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，1，4-二氧六環(huán)為溶劑，各組分摩爾比為:N-異丙基丙烯酰胺:4_氰基戊酸二硫代苯甲酸酯:偶氮二異丁腈=100?40:1:0.01?0.03，抽真空密封后于60?80°C反應5?8h后用乙醚沉淀分離出PNIPAM(聚(N-異丙基丙烯酰胺))，將PNIPAM溶于四氫呋喃中得到濃度為0.1?0.6g/mL的水溶液，再加入步驟4)所得Ac-PEG-g-1KVAV和偶氮二異丁腈，其中PNIPAM與Ac-PEG-g-1KVAV摩爾比為1:1，PNIPAM與偶氮二異丁腈摩爾比為9.5?23:1，密封抽真空后于60?80°C反應6?12h，反應結(jié)束后加入正己烷，沉淀物分離、干燥得到PNIPAM-b-PEG-g-1KVAV 前驅(qū)體；
[0013]6)制備具有生物活性的溫敏性水凝膠:將步驟5)所得PNIPAM-b-PEG-g-1KVAV前驅(qū)體溶于DMF( 二甲基甲酰胺)，再加入步驟5)所得PNIPAM、小分子交聯(lián)劑、步驟3)所得Ac-PEG-Ac以及AIBN，各組分摩爾比為:PNIPAM-b_PEG-g-1KVAV前驅(qū)體:PNIPAM:小分子交聯(lián)劑:Ac-PEG-Ac:AIBN = 1:280 ?700:3000 ?5000:100 ?300:200 ?500，抽真空密封后于60?80°C反應6?24h，所得凝膠用去離子水清洗后得到具有生物活性的溫敏性水凝膠。
[0014]按上述方案，步驟I)所述聚乙二醇分子量為2000 ;步驟3)所述聚乙二醇分子量為 4000。
[0015]按上述方案，步驟I)所述真空干燥條件為室溫條件下真空干燥12?48小時。
[0016]優(yōu)選的是，步驟4)所述IKVAV多肽為吉爾生化(上海)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號為 No:P110124-WY061697。
[0017]按上述方案，步驟6)所述小分子交聯(lián)劑為N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BISAM)、二乙烯基苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的一種。
[0018]本發(fā)明具有生物活性的溫敏性水凝膠的制備方法步驟如下:
[0019]I)制備HO-PEG-COOH:將聚乙二醇溶于四氫呋喃中，得到濃度為0.01?0.07g/mL的聚乙二醇溶液，向聚乙二醇溶液中加入CaH2，室溫下充分攪拌均勻后加入溴乙酸乙酯，其中聚乙二醇、CaH^溴乙酸乙酯摩爾比為1:0.85:1.7，充分攪拌后過濾，向濾液中加入正己烷，過濾出所得沉淀物，將沉淀物真空干燥后溶于水，得到濃度為0.2?0.6g/mL的水溶液，向所述水溶液中加入NaOH水溶液，使聚乙二醇與NaOH摩爾比為1:1.7，充分攪拌后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至12.5，加入二氯甲烷進行初次萃取，取水相并將pH值調(diào)至3，再向水相中加入二氯甲烷進行二次萃取，取有機相并加入正己烷，分離得到H0-PEG-C00H ;
[0020]2)制備Ac-PEG-COOH:將步驟I)所得H0-PEG-C00H溶解于四氫呋喃中得到濃度為0.01?0.lg/mL的H0-PEG-C00H溶液，并加入丙烯酰氯和三乙胺，使H0-PEG-C00H與丙烯酰氯、三乙胺摩爾比為1:2.3:2.5，室溫反應3?6小時后過濾，向所得濾液中加入正己烷，沉淀物分離、干燥得到Ac-PEG-COOH ；
[0021]3)制備Ac-PEG-Ac:將聚乙二醇溶解于四氫呋喃中，得到濃度為0.01?0.07g/mL的聚乙二醇溶液，向聚乙二醇溶液中加入丙烯酰氯和三乙胺，使聚乙二醇與丙烯酰氯、三乙胺的摩爾比為1:3:3.5，室溫反應I?4小時后過濾，向所得濾液中加入正己燒，沉淀物分尚、干燥得到Ac-PEG-Ac ；
[0022]4)制備Ac-PEG-g-1KVAV:將步驟2)制備的Ac-PEG-COOH溶解于四氫呋喃中，加入二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，使Ac-PEG-COOH與二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:2.5:2.5，活化0.5?