一種植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生菌是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使 寄主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀(至少暫時沒有感染癥狀)的微生物。在長期的進(jìn)化過程中與 宿主這個其特殊生境形成了特定的互利共生的關(guān)系，其生長代謝受宿主、外界環(huán)境因子等 多方面因素的制約。如今，內(nèi)生菌所發(fā)揮的重要的生理和生態(tài)作用及其在農(nóng)、林業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng) 域中的巨大應(yīng)用潛力，已逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點。因此，豐富多樣的植物內(nèi)生菌已成為 在尋找抗腫瘤、抗感染和抗植物病蟲害活性物質(zhì)的重要來源。本發(fā)明提供了一株新的植物 內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a，具有非常強的抗菌和殺蟲活性，且其能發(fā)酵產(chǎn)生高含量的布雷 菲德菌素 A (brefeldin A，BFA)
[0003] BFA 早在 1958 年由 Singleton 等從斜臥青霉菌（Penicillium decumbens)中首 次分離得到并被命名為ducumbin.直至1971年Weber等確定了該化合物的絕對構(gòu)型，并使 用brefeldin A作為其名稱。從而使這一名稱沿用至今。BFA是一種包含13元環(huán)的大環(huán)內(nèi) 酯類抗生素，它能反競爭性抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運至高爾基體，因此具有抗真菌、抗腫 瘤、抗病毒、抗線蟲等廣泛生物學(xué)活性。美國國家癌癥研究院研究發(fā)現(xiàn)BFA具有選擇性抑制 和殺死人腫瘤細(xì)胞活性。BFA通過不依賴于p53凋亡機制誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡，因此， BFA是作為誘導(dǎo)不依賴于p53的細(xì)胞凋亡的有效的備選化療藥物。Akira等聯(lián)合使用低劑 量BFA提高吉西他濱（gemcitabine)與對人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2細(xì)胞線的作用效果。可 見該化合物作為候選抗腫瘤藥物、醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體和重要的分子工具試劑具有較大的市 場需求。
[0004] BFA結(jié)構(gòu)式如下所示：
[000-。
【主權(quán)項】
1. 一種植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a，其特征在于：植物內(nèi)生真菌為布雷正青霉菌 F4a (Eupenicillium brefeldianum F4a)，于2012年12月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號：CCTCC M2012531。
2. -種權(quán)利要求1所述的植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a的應(yīng)用，其特征：利用所述 植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a用以制備布雷菲德菌素A。
3. -種權(quán)利要求1所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的 方法，其特征在于 ： 1) 將布雷正青霉菌F4a發(fā)酵種子液按照體積比1:10-1:20接種于PSB發(fā)酵培養(yǎng)基， 28°C 培養(yǎng) 7-15d ; 2) 將上述所得發(fā)酵液采用4-6層紗布過濾，固液分離得到上清液及菌絲體；過濾上清 液采用HP20大孔吸附樹脂固相萃取，用70-100%乙醇洗脫獲得粗提物；菌絲體經(jīng)丙酮提取 得提取物；合并兩部分提取物減壓濃縮后進(jìn)一步經(jīng)MeOH精制得到BFA含量超過50-65%的 粗提取物； 3) 將上述粗提取物用減壓快速硅膠柱色譜法分離，使用49:1-0:10 (v/v)二氯甲烷/ 甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集體積百分比為47:3-44:6的二氯甲烷/甲醇洗脫液，即得 純度為90-99%的布雷菲德菌素A ; 或，將所述粗提取物通過丙酮溶解，常溫下過夜，即得純度為90-99%的布雷菲德菌素A0
4. 按權(quán)利要求3所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的方 法，其特征在于： 所述步驟1)將菌株F4a用劃線法接種于PSA培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)4-6d ;然后 采用挖塊法接種于裝有50mL PSB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C 180rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng) 72h作為發(fā)酵種子液。
5. 按權(quán)利要求3所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的方 法，其特征在于：所述的化合物可用于制備成醫(yī)用、獸用或農(nóng)用非治療目的的抗真菌劑。
6. 按權(quán)利要求3所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的方 法，其特征在于：所述的化合物可用于制備成殺蟲劑。
7. 按權(quán)利要求5所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的方 法，其特征在于：所述的化合物可作為白色念珠菌、立枯絲核菌、鐮刀菌的抑菌劑。
8. 按權(quán)利要求6所述的利用植物內(nèi)生真菌布雷正青霉菌F4a制備布雷菲德菌素A的方 法，其特征在于：所述的化合物可制備為殺鹵蟲劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種新的植物內(nèi)生真菌及其制備布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）的應(yīng)用。植物內(nèi)生真菌為布雷正青霉菌F4a（Eupenicillium brefeldianum F4a），于2012年12月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC M2012531。本發(fā)明提供了布雷正青霉F4a能產(chǎn)生高含量的BFA，最高發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)1.9g/L；還提供了通過HP20固相萃取和快速硅膠柱色譜或純結(jié)晶技術(shù)制備獲得高純度的BFA。該方法生產(chǎn)成本低，且大大減少有機物的處理和污染，該發(fā)明具有良好的工業(yè)化前景。所制備的BFA具有抗真菌和殺蟲活性，是理想的獸用或農(nóng)用候選藥物。CCTCC M 201253120121218
【IPC分類】C12P17-08, A01P7-00, C07D313-00, C12R1-645, A61K31-365, C12N1-14, A01N43-22, A01P3-00, A61P31-10
【公開號】CN104877910
【申請?zhí)枴緾N201410072690
【發(fā)明人】潘華奇, 胡江春, 王書錦
【申請人】中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2014年2月27日