利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭提取乙酰膽堿酯酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶的提取方法，具體涉及利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭 提取乙酰膽堿酯酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰膽堿醋酶（acetylcholinesterase，AChE)是膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)過程中至關(guān)重 要的一種酶，它能夠快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh)成乙酸和膽堿，從 而終止ACh對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)正常傳遞。由于AChE對(duì)于 ACh的高速水解作用，使得其近年來得到越來越多的研宄人員的關(guān)注。AChE在生物防治、農(nóng) 藥殘留檢測(cè)、分子生物學(xué)以及各種神經(jīng)性疾病治療方面有廣泛的應(yīng)用。最近研宄表明，氨基 甲酸乙酯在一定程度上可以抑制AChE的活性，因此AChE有可能應(yīng)用在氨基甲酸乙酯（EC) 的檢測(cè)上。
[0003] AChE廣泛存在于各種動(dòng)植物組織中。目前，對(duì)于已經(jīng)研宄過的動(dòng)物，主要集中在肝 臟、血液和腦組織中，例如馬血清，鲅魚腦組織等。植物酯酶的研宄尚未深入，有一些研宄表 明，糧食作物中酶活相對(duì)較高，但是對(duì)于大部分的糧食原料來說，乙酰膽堿酯酶的提取同時(shí) 會(huì)造成糧食原料的浪費(fèi)。由于酶源及制備工藝復(fù)雜等問題的存在，價(jià)格昂貴。因此需要探 索原料豐富、成本較低及酶活較高的酶源，以利于推進(jìn)AChE在各個(gè)方面的應(yīng)用研宄。而以 雞肉加工中的廢棄器官及組織提取乙酰膽堿酯酶，可以達(dá)到對(duì)廢棄物的綜合利用，又可以 實(shí)現(xiàn)原料的高值化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭提取乙酰膽堿酯酶的方法，所 得產(chǎn)品可用于醫(yī)藥、葡萄酒和農(nóng)殘中有害成分氨基甲酸乙酯及其衍生物的檢測(cè)等方面的應(yīng) 用研宄。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案如下。
[0006] 利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭提取乙酰膽堿酯酶的方法，包括以下步 驟：
[0007] (1)乙酰膽堿酯酶的制備：
[0008] (1.1)將洗凈烘干的表面皿稱重，將新鮮的縱向斬開的雞頭用生理鹽水沖洗干 凈，用鑷子將雞腦取出至于表面皿中，去除非腦組織后再次稱重；
[0009] (1. 2)將雞腦與含TritonX-IOO的磷酸鹽緩沖液混合，得到混合液；
[0010] (1. 3)將步驟（1. 2)所得混合液用勻漿機(jī)勻漿1~5min后，靜置10~60min，得 到勻漿液；
[0011] (1. 4)將勻漿液以3000~10000r/min，0~4°C離心10~30min，取其上清液，即 得乙酰膽堿酯酶粗提液；
[0012] (I. 5)將步驟（I. 4)所得的乙酰膽堿酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，進(jìn)行真 空冷凍干燥，收集后即得乙酰膽堿酯酶制品；
[0013] (2)乙酰膽堿酯酶酶活的測(cè)定：
[0014] (2. 1)取0· 02~1.0 mg的乙酰膽堿酯酶制品，用蒸餾水溶解后，得到酶液，在IOmL 的比色管內(nèi)，加入1~5mL磷酸鹽緩沖液，再加入0. 01~0.1 mL酶液混勻，于25~60°C恒 溫水浴鍋中保溫5~60min ;
[0015] (2. 2)向加入0. 1~1.0 mL碘化硫代乙酰膽堿溶液和0. 1~1.0 mL DTNB溶液后混 勻；
[0016] (2. 3)于400~500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用比色皿比色，記錄吸光度，根據(jù)吸光度變化值 來計(jì)算酶活和比活力，比活力
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭提取乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 乙酰膽堿酯酶的制備： (1. 1)將洗凈烘干的表面皿稱重，將新鮮的縱向斬開的雞頭用生理鹽水沖洗干凈，用鑷 子將雞腦取出至于表面皿中，去除非腦組織后再次稱重； (1. 2)將雞腦與含TritonX-IOO的磷酸鹽緩沖液混合，得到混合液； (1. 3)將步驟（1. 2)所得混合液用勻漿機(jī)勻漿1~5min后，靜置10~60min，得到勻 漿液； (1. 4)將勻漿液以3000~10000r/min，0~4°C離心10~30min，取其上清液，即得乙 酰膽堿酯酶粗提液； (1.5)將步驟（1.4)所得的乙酰膽堿酯酶粗提液的上清液置于表面皿中，進(jìn)行真空冷 凍干燥，收集后即得乙酰膽堿酯酶制品； (2) 乙酰膽堿酯酶酶活的測(cè)定： (2. 1)取0. 02~1.0 mg的乙酰膽堿酯酶制品，用蒸餾水溶解后，得到酶液，在IOmL的比 色管內(nèi)，加入1~5mL磷酸鹽緩沖液，再加入0. 01~0.1 mL酶液混勻，于25~60°C恒溫水 浴鍋中保溫5~60min ; (2. 2)向加入0. 1~1.0 mL碘化硫代乙酰膽堿溶液和0. 1~1.0 mL DTNB溶液后混勻； (2. 3)于400~500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用比色皿比色，記錄吸光度，根據(jù)吸光度變化值來計(jì) 算酶活和比活力，比活力（U/
式中：A - 3min時(shí)吸光度的變化值； V-反應(yīng)體系總體積（L); ε -消光系數(shù)，1. 36X 104lV(mol Xcm); d一比色皿光程，Icm ; T一反應(yīng)時(shí)間，3min。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于提取乙酰膽堿酯酶的原料采用廢棄 器官雞腦。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述的含TritonX-IOO的磷酸 鹽緩沖液中TritonX-IOO濃度為(λ 1%~3. 0% (v/v)，所述比例為1 :2~I :10(g/mL);所 述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 02~0. 2M，pH 7. 0~9. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的進(jìn)行真空冷凍干燥的液體厚度為 0· 1 ~2. Ocm0
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2. 1)中所述的磷酸鹽緩沖液pH 6. 0~10. 0,濃度為0. 1M，所用恒溫水浴鍋溫度在25~60°C，保溫時(shí)間為5~60min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碘化硫代乙酰膽堿溶液濃度為5~ 30mg/mL〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述波長(zhǎng)范圍在400~500nm。
【專利摘要】本發(fā)明提供利用雞肉加工過程中的廢棄器官-雞頭提取乙酰膽堿酯酶的方法。本發(fā)明是以雞肉加工中的廢棄器官-雞腦為酶的材料來源，其工藝步驟包括：雞腦的處理、勻漿液的制備、冷凍離心及粗提液的真空冷凍干燥，即可得到乙酰膽堿酯酶制品。由于傳統(tǒng)酶源制得的產(chǎn)品成本高、產(chǎn)量低，而進(jìn)口酶源價(jià)格昂貴，周期較長(zhǎng)。本發(fā)明經(jīng)酶源的篩選，充分利用了雞肉加工過程中廢棄器官雞腦，高值化利用，降低了成本，且經(jīng)優(yōu)化及檢驗(yàn)，酶活較高，粗酶液酶活可達(dá)到3.0～5.0U/mL，比活力可達(dá)到0.35～0.5U/mg，為后續(xù)乙酰膽堿酯酶純品的制備提供了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N9-18
【公開號(hào)】CN104877975
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510271975
【發(fā)明人】黃惠華, 張佳佳, 黃秋婷
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年5月23日