重組溶瘤性ii型單純皰疹病毒及其藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組單純皰瘆病毒，具體地指一種重組溶瘤性單純皰瘆病毒II型及 其藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純皰瘆病毒（Herps simplex virus，HSV)是一種長約154kb的雙鏈DNA病毒， 可在受染宿主細胞核中復(fù)制。HSV載體具有以下優(yōu)點：1)宿主細胞廣泛；2)病毒滴度高；3) 外源基因容量大。HSV載體的缺點在于它的毒性。
[0003] 例如，ICP47蛋白影響與抗原處理相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白（TAPl和TAP2)的功能，阻礙MHC I分子的抗原表呈過程。所以剔除ICP47基因有利于增強免疫反應(yīng)。另外，剔除ICP47基 因，使下游的USll基因表達增加，USll可對抗PKR對病毒生長繁殖的抑制。ICP34. 5為神 經(jīng)毒因子，缺失了 ICP34. 5的病毒能選擇性地殺傷腫瘤細胞，其機理為：ICP34. 5能對抗PKR 對翻譯起始因子elf-2a的滅活，使病毒順利繁殖。因此，失去了 ICP34. 5的病毒進入正常 細胞后，誘導(dǎo)干擾素/PKR通路活化，進而導(dǎo)致elf_2a失活，病毒蛋白不能合成、病毒繁殖受 阻。而大多數(shù)腫瘤細胞的干擾素/PKR信號通路受損。因此，失去了 ICP34. 5的病毒可以在 腫瘤細胞內(nèi)生長繁殖。以及ICP6基因編碼核糖核苷酸還原酶，該酶為病毒DNA復(fù)制提供必 需的前體，在分裂細胞（如腫瘤細胞）中為非必需基因，剔除該基因可以增加病毒載體的載 量。
[0004] 眾所周知，DNA核酸疫苗如CADV的缺點是體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低，但如用體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率 高的病毒載體攜帶CADV，就可客服CADV這一缺點。溶瘤性HSV不僅有強效的溶瘤作用，還 可作為基因載體攜帶并高效表達腫瘤相關(guān)抗原，作為治療性免疫基因疫苗。二者的聯(lián)合也 克服了溶瘤HSV單獨不能強有力地誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫的弱點。
[0005] 2010年，申請?zhí)枮?010101162753的中國發(fā)明專利公開了一種重組II型單純皰瘆 病毒載體及其制備方法、重組病毒、藥物組合物及應(yīng)用，發(fā)明人劉濱磊剔除了野生II型單 純皰瘆病毒HG52株的基因組上的ICP34. 5基因和ICP47基因，并在剔除了 ICP34. 5基因的 位點上插入人粒-巨噬細胞集落刺激因子表達盒。其重組病毒具有安全性好、溶癌活性高、 抗腫瘤的免疫反應(yīng)強的特點。
[0006] OHSV2-GM-CSF表達的GM-CSF雖然能促進DC的成熟，但病毒溶瘤釋放的腫瘤相關(guān) 抗原（如端粒酶抗原）并不一定能有效地被DC細胞捕獲并遞呈。而 〇HSV2-SLC-Te-Fc則 解決了這一問題。SLC-Te-Fc融合蛋白上有腫瘤廣譜抗原端粒酶（Te，又稱TERT)的序列。 其SLC趨化吸引免疫細胞（DC、T淋巴細胞等）到腫瘤部位，F(xiàn)c則可與DC上相應(yīng)受體結(jié)合， 使DC能高效捕獲Te抗原并遞呈給T細胞，從而更有效地激活特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種重組溶瘤性II型單純皰瘆病毒及其藥 物組合物。該重組溶瘤性II型單純皰瘆病毒，也克服了溶瘤HSV單獨不能強有力地誘導(dǎo)特 異性抗腫瘤免疫的弱點。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種重組溶瘤性II型單純皰瘆病毒，所述病 毒的基因組上敲除了兩個ICP34. 5基因和一個ICP47基因，所述兩個ICP34. 5基因的位點 上分別插入人端粒酶趨化基因 SLC-Te-Fc表達盒，所述人端粒酶趨化基因 SLC-Te-Fc表達 盒依次連接有CMV啟動子、次級淋巴組織趨化因子SLC、端粒酶Te (又稱TERT)、免疫球蛋白 Fc段和牛生長激素多聚腺苷序列BGHpA。該病毒分類命名為II型單純皰瘆病毒，Herpes SimplexVirus Type2并于2014年1月3日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏地點：北京。其保藏編號為CGMCC No. 8709。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種重組溶瘤性II型單純皰瘆病毒的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)從野生型II型單純皰瘆病毒HG52株中剔除ICP47基因，構(gòu)建HG52dICP47重 組II型單純皰瘆病毒：
[0011] a.提取II型單純皰瘆病毒HG52株的基因組DNA ;
[0012] b.構(gòu)建含有ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的質(zhì)粒pdICP47H2 :
[0013] bl.使用如下所示的擴增ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和擴增ICP47基因下游側(cè)翼 區(qū)序列的引物，以步驟a得到的基因組DNA為模板，PCR擴增ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和 下游側(cè)翼區(qū)序列；
[0014] 擴增 ICP47 基因正向引物 146554Agagtcacgacgcatttgccc 146574
[0015] 上游側(cè)翼區(qū)序列反向引物 14m5ATACGATCTCGTCGACCGGGG 147755
[0016] 擴增 ICP47 基因正向引物 148°33CATGGTGTCCCGTCCACGAAG 148。53
[0017] 下游側(cè)翼區(qū)序列反向引物 149211ggttcgtggtaatgagatgcc 149191
[0018] b2.將步驟bl擴增所得PCR產(chǎn)物上游側(cè)翼區(qū)序列插入到PSP73質(zhì)粒的SmaI位點， 得到 PSP73ICP47US 質(zhì)粒；
[0019] b3.將步驟bl擴增所得PCR產(chǎn)物下游側(cè)翼區(qū)序列插入到pSP73質(zhì)粒的SmaI位點， 得到PICP47DS質(zhì)粒；
[0020] b4.用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI從步驟b3獲得的pICP47DS質(zhì)粒中酶切出下游 側(cè)翼區(qū)序列，并將該下游側(cè)翼區(qū)序列插入到步驟b2獲得的pSP73ICP47US質(zhì)粒的BglII位 點，得到含ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的pdICP47H2質(zhì)粒，
[0021] b5.將巨細胞病毒IE啟動子控制的綠色熒光蛋白表達盒插入到步驟b4獲得的 pdICP47H2 質(zhì)粒的 EcoRV 位點，得到 pdICP47H2-GFP 質(zhì)粒；
[0022] c.構(gòu)建剔除ICP47基因的重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47 :
[0023] cl.將步驟a得到的全長病毒DNA與步驟b得到的pdICP47H2-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK 細胞，全長病毒DNA上的ICP47基因與pdICP47H2-GFP質(zhì)粒上的綠色熒光蛋白表達盒發(fā)生 同源重組，發(fā)生重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光；
[0024] c2.挑選綠色熒光毒斑，純化出重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47-GFP ;
[0025] c3.提取重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47-GFP的基因組DNA ;
[0026] c4.將步驟c3得到的重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47-GFP的全長病毒DNA與 步驟b4獲得的pdICP47H2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK細胞，重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47-GFP 上的綠色熒光蛋白表達盒發(fā)生同源重組被剔除；
[0027] c5.挑選無熒光毒斑，純化出重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47 ;
[0028] (2)剔除ICP34. 5基因，構(gòu)建重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47d34. 5-GFP :
[0029] A.提取重組II型單純皰瘆病毒HG52dICP47的基因組DNA ;
[0030] B.構(gòu)建含有ICP34. 5基因上游側(cè)翼區(qū)序列和下游側(cè)翼區(qū)序列的質(zhì)粒pH2dI34. 5 :
[0031] BI.使用如下所示的擴增ICP34. 5基因上游側(cè)翼區(qū)序列和擴增ICP34. 5基因下游 側(cè)翼區(qū)序列的引物，以步驟a得到的基因組DNA為模板，PCR擴增ICP34. 5基因上游側(cè)翼區(qū) 序列和下游側(cè)翼區(qū)序列；
[0032] 擴增 ICP：34·5 基因正向引物 aaatcagctg124356cggtgaaggtcgtcgtcagag124376
[0033] 上游側(cè)翼區(qū)序列 反向引物 aaattctaga125661gccggcttcccggtatggtaa125641
[0034] 擴增 ICP34.5 基因正向引物 AAATGATATC126943CAGCCCGGGCCGTGTTGCGGG126963
[0035] 下游側(cè)翼區(qū)序列 反向引物 aaatagatct12764°ctctgacctgagtgcaggtta12762°
[0036] B2.將步驟BI擴增所得PCR產(chǎn)物上游側(cè)翼區(qū)序列插入到pSP72質(zhì)粒的PvuII/Xbal 位點，得到pSP72H2d34. 5US質(zhì)粒；
[0037] B3.將步驟Bl