一種重組豬偽狂犬病毒gE/gI雙基因缺失株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組豬偽狂犬病毒gE/gl雙基 因缺失株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬偽狂犬病病毒PRV (Pseudorabies virus)屬于痕疼病毒科a痕疼病毒 亞科水泡病毒屬豬皰瘆病毒I型，豬是該病毒的唯一自然宿主，引起豬的偽狂犬病 (Pseudorabies，PR)。該病在豬群多呈暴發(fā)流行，主要危害母豬群，引起母豬流產(chǎn)或垂直傳 播給仔豬，造成初生仔豬大量死亡，給我國乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前 尚無治療PR的有效藥物，因此疫苗接種成為控制該病發(fā)生和流行的主要措施。世界上使用 最廣泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近幾年我國豬偽狂犬疫病流行現(xiàn)狀為現(xiàn) 有該疫苗不能完全保護(hù)新流行PRV的攻擊，給免疫豬場造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要 提供最新流行毒株制備的疫苗就成為豬偽狂犬病病毒病防治領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種重組豬偽狂犬病毒gE/gl雙基因缺失株及其應(yīng)用，即由 篩選出的豬偽狂犬病病毒的基因缺失株作為抗原制備的疫苗，本發(fā)明的疫苗對目前流行的 豬偽狂犬病病毒的攻擊能夠提供良好的免疫保護(hù)效力。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種豬偽狂犬病毒基因缺失株，是由保藏編號為CGMCC No. 10266 的豬偽狂犬病病毒株進(jìn)行g(shù)E和gl基因缺失后制成的。
[0005] 本發(fā)明另一個(gè)方面提供上述豬偽狂犬病毒基因缺失株在制備疫苗中的應(yīng)用；
[0006] 本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種豬偽狂犬病病毒疫苗，由抗原和保護(hù)劑組成的，其中 抗原包含有上述的豬偽狂犬病毒基因缺失株。
[0007] 其中的保護(hù)劑為目前使用的病毒疫苗用保護(hù)劑，其一種實(shí)施例具體成分為蔗糖和 明膠的水溶液，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為20%和4. 8%。
[0008] 上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、鏈霉素終濃度為200單位/ml ;
[0009] 本發(fā)明制備的疫苗可有效預(yù)防豬偽狂犬病，而且作為抗原的豬偽狂犬病病毒為基 因缺失株，通過水平傳播感染在小鼠體連續(xù)傳代，均未見毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定，符合 豬偽狂犬病病毒缺失疫苗株無毒力返強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護(hù)，具 有很好的商品化開發(fā)前景。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù) 方案的基礎(chǔ)上，可以選用本領(lǐng)域常用的方法步驟，而不僅限于本發(fā)明說明書實(shí)施例的具體 記載。
[0011] 實(shí)施例1 :CGMCC No. 10266豬偽狂犬病病毒株的選育
[0012] 近年來，我國多個(gè)豬場都發(fā)生了偽狂犬病，其中大部分是種豬場，而發(fā)病豬群之前 已經(jīng)注射了偽狂犬疫苗，推測感染的病毒發(fā)生了變異；因此從發(fā)病豬群中進(jìn)行了豬偽狂犬 病毒的篩選。
[0013] 取發(fā)病豬內(nèi)臟樣本，包括：心臟、肝臟、肺臟、脾臟、扁桃體和淋巴結(jié)等。將內(nèi)臟樣本 與PBS(0. 1Μ，ρΗ7. 2)以V/V1:5制成勻漿，反復(fù)凍融3次，3000r/min離心15min，取上清中 加雙抗，37°C感作lh，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾除菌。取Iml病毒濾液接種于長成單層的Vero 細(xì)胞，盲傳三代，觀察細(xì)胞病變（CPE)。將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行空斑純化，純化后的 病毒分裝保存至_7〇°C備用，并測定病毒含量。選取作為疫苗研制的豬偽狂犬病病毒QD株 (皰瘆病毒I型Porcine herpesvirus Type I )已于2015年3月6日保藏于北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研宄所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10266。
[0014] 對于本發(fā)明篩選的毒株進(jìn)行PCR檢測，測序后進(jìn)行blast分析，發(fā)現(xiàn)保藏編號為 CGMCC No. 10266的豬偽狂犬病病毒的gE基因與2012年之后報(bào)道的豬偽狂犬病病毒的相對 應(yīng)的序列雖然存在至少2個(gè)氨基酸的差異，但是親緣關(guān)系較近，均處于一個(gè)相對獨(dú)立的分 支中，與之前分尚的毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。且與最近分尚的毒株具有相同的分子特征，即在gE 基因第48位和第492-496位各有1個(gè)天冬氨酸的插入，其他報(bào)道也證實(shí)也這一點(diǎn)。而以前 分離到的毒株只個(gè)別有一個(gè)位置插入氨基酸，絕大部分沒有插入。因此可以推測上述的差 異正是導(dǎo)致已有的豬偽狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。
[0015] 該毒株作100倍稀釋后，與等量豬偽狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被尚免血 清特異性中和；而與等量豬細(xì)小病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼 吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒抗血清中和組，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的 細(xì)胞病變，可見該病毒特異性好。該毒株制備的疫苗免疫BALB/C小鼠后，能降低小鼠的死 亡率。
[0016] 實(shí)施例2 :重組豬偽狂犬病毒gE/gl雙基因缺失株的構(gòu)建
[0017] 從分離的豬偽狂犬病病毒（CGMCC No. 10266)中提取該分離株的DNA，采用基因 工程的方法對該分離株進(jìn)行毒力基因 gE和gl基因的缺失，并在細(xì)胞上進(jìn)行拯救后命名為 PRV/gE7gr，繁毒，加入保護(hù)劑后作為種子毒?！揪唧w實(shí)施方式】如下：
[0018] IPCR 引物
[0019] 參考PRV全基因組序列（BK001744)，自行合成系列引物，分別用來擴(kuò)增位于 US7(gI)基因和US8(gE)基因兩側(cè)（含部分gl和gE基因）的可用于同源重組的左臂片段 (L)和右臂片段（R)。其中L包括部分US6基因和部分gl基因，R包括部分gE基因、全部 的US9基因和部分US2基因。另外同時(shí)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EGFP和EGFP真核表達(dá)盒，以及用于 鑒定基因缺失的引物。引物序列及預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小見表1。
[0020] 表1 :本研宄中用到的引物
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的疫苗由抗原和保護(hù)劑組成的，其中抗原包 含有由保藏編號為CGMCC No. 10266的病毒株進(jìn)行毒力基因缺失后制成的減毒病毒株。
2. 如權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的毒力基因?yàn)間E和gl基 因。
3. 如權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的保護(hù)劑為病毒疫苗用保 護(hù)劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的保護(hù)劑為蔗糖和明膠的 水溶液。
5. 如權(quán)利要求4所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的蔗糖和明膠在疫苗中的 質(zhì)量百分比終濃度分別為20%和4. 8%。
6. 如權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的疫苗中加入了抗生素。
7. 如權(quán)利要求6所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的抗生素為青霉素和鏈霉 素。
8. 如權(quán)利要求7所述的豬偽狂犬病疫苗，其特征在于，所述的青霉素和鏈霉素的終濃 度分別為200單位/ml。
9. 權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病疫苗的制備方法，是采用基因工程的方法將豬偽狂犬 病病毒基因組的毒力基因進(jìn)行缺失，在細(xì)胞上進(jìn)行拯救后擴(kuò)毒獲得的病毒液；加入保護(hù)劑 制成的。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種豬偽狂犬病病毒疫苗，由抗原和保護(hù)劑組成的，其中抗原包含有由保藏編號為CGMCC No.10266的豬偽狂犬病病毒株進(jìn)行毒力基因gE和gI缺失后制成的減毒病毒株。本發(fā)明制備的疫苗可有效預(yù)防豬偽狂犬病，而且作為抗原的豬偽狂犬病病毒為基因缺失株，通過水平傳播感染在小鼠體連續(xù)傳代，均未見毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定，符合豬偽狂犬病病毒缺失疫苗株無毒力返強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護(hù)，具有很好的商品化開發(fā)前景。CGMCC No.1026620150306
【IPC分類】A61P31-22, A61K35-763, C12N7-04
【公開號】CN104877972
【申請?zhí)枴緾N201510246482
【發(fā)明人】李明義, 劉杉杉, 孫偉, 劉陽, 李曉林, 趙航, 李彥鳳, 葛棟, 李佳琪
【申請人】山東信得科技股份有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月15日