一種嗜松青霉菌株及其該菌株制備右旋糖酐酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種產(chǎn)右旋糖酐酶的嗜松青霉菌株的分離，以及利用該菌株制備高酶活性的右旋糖酐酶的工藝。
【背景技術(shù)】
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[0002]右旋糖酐(Dextran)是若干葡聚糖脫水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷鍵連接而成，由腸膜明串珠菌(Leuconstoc mesenter1des)產(chǎn)生的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase ；E.C.2.4.1.5)合成的右旋糖酐含有95%的α -1, 6糖苷鍵，同時(shí)含有少量其它糖苷鍵的分支結(jié)構(gòu)。根據(jù)分子量的不同，右旋糖酐可分為以下幾種類(lèi)型:(I)微分子右旋糖酐(右旋糖酐10，平均分子量1.0萬(wàn)以下)；(2)小分子右旋糖酐(右旋糖酐20，平均分子量1.0萬(wàn)-2.5萬(wàn))；(3)低分子右旋糖酐(右旋糖酐40，平均分子量2.5萬(wàn)-5.0萬(wàn))；
(4)中分子右旋糖酐(右旋糖酐70，平均分子量5.0萬(wàn)-9.0萬(wàn))；(5)大分子右旋糖酐(平均分子量9.0萬(wàn)以上)。在醫(yī)藥工業(yè)中，分子量為70kDa、40kDa、20kDa的右旋糖酐是目前公認(rèn)的優(yōu)良血漿代用品之一，有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內(nèi)凝血作用，臨床主要用于治療失血性休克等。小分子右旋糖酐近來(lái)被發(fā)現(xiàn)，可以避免由于右旋糖酐70及40而引起的人體自身免疫的變態(tài)反應(yīng)。偏低分子量的右旋糖酐通常是衍生化的優(yōu)良材料，右旋糖酐鐵可以治療缺鐵性貧血，增強(qiáng)核磁共振成像技術(shù)；而低分子量右旋糖酐的硫酸酯(硫酸葡聚糖)具有類(lèi)似于肝素(一種天然的硫酸多糖)的抗凝血特性，對(duì)核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)具有親和性，是核糖核酸酶的一種強(qiáng)抑制劑，近來(lái)硫酸葡聚糖還被用于抗病毒研宄，發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖有可能成為抗HIV藥物。分子量更小的低聚異麥芽糖則被用于益生元。目前我國(guó)90%以上的右旋糖酐制造企業(yè)多采用鹽酸水解高分子右旋糖酐的工藝，先利用右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，再利用鹽酸進(jìn)行水解得到不同分子量的藥用級(jí)右旋糖酐，由于此工藝生產(chǎn)的藥用級(jí)右旋糖酐含有大量的氯化物及氮化物而嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的質(zhì)量，產(chǎn)品在臨床使用過(guò)程中常出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，可引起皮膚反應(yīng)、嚴(yán)重的呼吸和循環(huán)衰竭，甚至導(dǎo)致死亡。同時(shí)由于利用鹽酸水解需要高溫高酸等惡劣條件，不利于環(huán)保、低碳。如果采用本發(fā)明的嗜松青霉產(chǎn)生的右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，通過(guò)控制反應(yīng)條件調(diào)控催化水解的右旋糖酐分子量，就能減少氯化物對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的不良影響，同時(shí)由于本發(fā)明制備的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐時(shí)，能夠優(yōu)先降解大分子量的右旋糖酐，然后再進(jìn)一步降解中小分子量的右旋糖酐，如此便能夠得到分子量分布較集中的高品質(zhì)右旋糖酐。目前國(guó)內(nèi)外的右旋糖酐酶主要是從薄青霉(Penicillium Iilacinum)和細(xì)麗毛殼屬(Chaetomiumsp.)等菌株培養(yǎng)得到，而上述菌株產(chǎn)生的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐時(shí)不具備優(yōu)先降解大分子糖酐的能力，得到的產(chǎn)品分子量分布不集中，同時(shí)上述兩種菌株制備的右旋糖酐酶酶活力較低，且制備成本高，目前尚未有大量利用右旋糖酐酶水解高分子糖酐制備藥用級(jí)右旋糖酐的報(bào)道。
[0003]在制糖工業(yè)中，右旋糖酐的存在會(huì)增加制糖過(guò)程困難，主要體現(xiàn)在糖液粘度增加、過(guò)濾困難、能耗增加等，同時(shí)還會(huì)直接造成糖分的損失和品質(zhì)的下降。因此這些問(wèn)題是我國(guó)糖業(yè)界一個(gè)急需解決的問(wèn)題。利用本發(fā)明制備的右旋糖酐酶能夠催化水解右旋糖酐的α -1, 6糖苷鍵，并釋放出異麥芽糖和低聚異麥芽糖，最終的水解產(chǎn)物為異麥芽三糖、異麥芽四糖和異麥芽五糖。目前國(guó)內(nèi)外的右旋糖酐酶主要是從薄青霉(Penicillium Iilacinum)和細(xì)麗毛殼屬(Chaetomium sp.)等菌株培養(yǎng)得到，由于制備得到的右旋糖酐酶酶活力較低、制備成本高，因此未有大量應(yīng)用于制糖工業(yè)的報(bào)道。因此本發(fā)明的高酶活性的右旋糖酐酶對(duì)制糖行業(yè)的清潔生產(chǎn)、技術(shù)進(jìn)步具有顯著的積極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種從土壤中篩選出的高產(chǎn)右旋糖酐酶的嗜松青霉菌株以用于制備高酶活性的右旋糖酐酶。
[0005]本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題采用如下方案:
[0006]本發(fā)明提供一種從土壤中篩選出的高產(chǎn)右旋糖酐酶的嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)菌株，該菌株保藏名稱(chēng)為:嗜松青霉(Penicillium pinophilum) H6，分類(lèi)命名及拉丁文名為Penicillium pinophilum，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期:2014年6月3日，保藏號(hào)為CGMCC N0.9260，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0007]本發(fā)明的微生物H6菌株具有下述性質(zhì):
[0008]形態(tài)特征:
[0009]菌株H6在PDA培養(yǎng)基(配方??每10ml水中含有馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂1.8g)上28°C恒溫培養(yǎng)2-3d后肉眼可看到清晰的菌絲體，菌絲較粗而長(zhǎng)。生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)5-6d菌落較大，生長(zhǎng)沒(méi)有局限性，菌落可以擴(kuò)展到整個(gè)培養(yǎng)皿。分生孢子面為青色，反面略帶紅色，菌落呈現(xiàn)絨毛狀和棉絮，菌落與培養(yǎng)基的連接緊密。在顯微鏡下觀察菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，且單獨(dú)直立或集合成菌絲束，無(wú)足細(xì)胞，頂端生有掃帚狀的分枝，帚狀枝輪生或單生。
[0010]ITS rDNA 基因序列:
[0011]利用ITS rDNA特異引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到568bp的目的DNA片段，利用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示菌株H6的568bp的目的DNA序列與嗜松青霉的基因序列相似性最高，同源性高達(dá)100%。同時(shí)將得到的菌株H6的568bp的目的DNA片段序列提交到GenBank上，獲得GenBank登錄號(hào)為KF751644。
[0012]本發(fā)明還提供了嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6在制備高酶活性的右旋糖酐酶中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的微生物H6菌株的分離方法是:
[0014]在99ml無(wú)菌水中加入Ig 土樣(土樣分別取自安徽合肥、安徽鮮;t阜、四川成都)制備土壤稀釋液，在PDA培養(yǎng)基內(nèi)加入青霉素溶液(100ml加入50 μ I)，倒入培養(yǎng)皿中，靜止冷卻成平板。采用稀釋涂布法將稀釋后的土壤溶液分別涂布于平板上，然后倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)出后，用接種針將菌株挑取到另一滅菌的篩選培養(yǎng)基(配方:Dextran 70kDalg，NaNO30.2g，蛋白胨 0.4g，K2HPO4.3H20 0.4g，MgSO4.7H20 0.02g，KCl
0.02g，F(xiàn)eSO4.7H200.001g，瓊脂1.6g，水100ml，pH5.0-5.5)上進(jìn)行劃線分離，然后將能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落挑取下來(lái)，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基(配方:Dextran 7kDa 1.5g，ΚΝ032.5g, K2HPO4.3Η20 0.1g,MgSO4.7Η20 0.05g,FeSO4.7Η20 0.0Olg, 100ml,ρΗ3.0-3.5)中，于33°C、200r/min恒溫繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)8d。將發(fā)酵液用于平板透明圈法。
[0015]經(jīng)過(guò)平板透明圈法，將菌株發(fā)酵后的上清液經(jīng)過(guò)纖維素酯微孔濾膜(規(guī)格Φ 25mm，孔徑0.22 μ m)無(wú)菌過(guò)濾處理。在右旋糖酐瓊脂平板上打孔，將篩選菌株的培養(yǎng)液150 μ I加入孔中，同時(shí)在每一塊檢測(cè)板中，以無(wú)菌水(150 μ I)做為陰性對(duì)照，以商業(yè)右旋糖酐酶液(150 μ I)做陽(yáng)性對(duì)照。在28°C條件下放置24h后，觀察孔周?chē)a(chǎn)生的透明圈大小，透明圈越大表明培養(yǎng)液所含的右旋糖酐酶活力越高。選擇產(chǎn)生較大透明圈的菌株進(jìn)行DNS比色法復(fù)篩。
[0016]將初篩得到的活性菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液用DNS比色法檢測(cè)酶活力大小。在酶反應(yīng)體系中加入待測(cè)液測(cè)定酶活，右旋糖酐酶的活力測(cè)定為將4ml 0.02mol/L pH = 5.0的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐70kDa溶液置于45°C保溫lOmin，再加入適當(dāng)稀釋的酶液Iml保溫Ih后，利用3，5- 二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定生成的還原糖。以在上述條件下每小時(shí)產(chǎn)生Img還原糖(葡萄糖當(dāng)量)所需