ng，5，和 3’引物各 20 pmol，1Xbuffer 5 μ 1，dNTP 各 20 μ M，高保真 KOD plus(TOYOBO) Iulo按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒、55°C退火30秒、68°C延伸1.5分鐘，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Sal I和Afoi I酶切位點(diǎn)克隆到大腸桿菌表達(dá)載體PGEX-4T1 (GE life sciences)，測(cè)序驗(yàn)證其正確后得到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T1-SDG708。
[0022]GST融合的SDG708重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化依據(jù)Glutath1neSepharose 4 Fast Flow (GE life sciences)的用戶手冊(cè)進(jìn)行。
[0023]組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的體外活性測(cè)定按Rea等(Nature，2000，406:593 - 599)的方法進(jìn)行:在 30 μ I MAB 測(cè)活緩沖液(50 mM Tris-HCl (pH 8.5),20 mM KCl, 10 mMMgC12，250 mM Sucrose, 100 μ M ZnC12，10 mM β-mercaptoethanol)中，加入的酶(GST —SDG708)，底物(核心組蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4，購(gòu)自 MiIIipore)和 250 nCi methyl-14C_SAM(GE life sciences)，混合均勻，37°C反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)15% SDS — PAGE分離并染色脫色，凝膠于70°C真空干燥2 hrs后放射自顯影。
[0024]圖1中上圖為SDS — PAGE電泳考染結(jié)果，下圖為放射自顯影結(jié)果，酶活底物分別為組蛋白H3上帶有正常36位賴氨酸(H3K36)的核小體和賴氨酸突變?yōu)楸彼?H3K36A)的重組核小體，已知的H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶GST-SDG714蛋白作為對(duì)照，結(jié)果顯示GST — SDG708具有專一性的組蛋白H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0025]實(shí)施例3.檢測(cè)對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用一、反義表達(dá)載體的構(gòu)建
利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)，以基因?yàn)榘谢?，?gòu)建RNA干擾載體。以實(shí)施例1得到的PUC19- SDG708為模板，分別以兩對(duì)不同的引物PCR擴(kuò)增SDG708U 5’端第363到612位的核苷酸序列，作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA雙鏈。所用的引物對(duì) I 為:5，_ ccatggctgcagAtggaaggaagccaagagga-3，( SEQ ID No:7)和5，— gaattcAaagttgtagtcataggata — 3，( SEQ ID No:8)，所得 PCR 產(chǎn)物為 fSDG708i(forward)。引物對(duì) 2 為 5，- tctagaAtggaaggaagccaagagga-3，( SEQ ID No:9)和5，一 aagcttAaagttgtagtcataggata — 3，( SEQ ID No: 10),所得 PCR 產(chǎn)物為 rSDG708i(reversed)。為了便于后續(xù)的載體構(gòu)建，在fSDG708i的5’和3’端分別添加了 AfcoI和EcoR I的限制性酶切位點(diǎn)，在rSDG708i的5’和3’端分別引入了 I和HindVll的限制性酶切位點(diǎn)。
[0026]為了便于RNAi載體的構(gòu)建，在連接正反兩條DNA分子的內(nèi)含子(由法國(guó)植物分子生物學(xué)研宄所贈(zèng)送)兩端通過(guò)PCR方法分別引入了 II和I的限制性酶切位點(diǎn)，所用引物為:5，— aaaagcttccaatttggtaaggaaataatt 一 3，( SEQ ID No: 11)和 5，一aagaattctttcgaacccagcttccc—V ( SEQ ID No:12)。
[0027]將fSDG708i經(jīng)Nco I和&oR I雙酶切，內(nèi)含子經(jīng)HindYW和&oR I雙酶切，rSDG708i經(jīng)Xba I和Hindi 11，連接入經(jīng)Nco I和ZhI雙酶切的pHB載體(由中科院上海植物生理研宄所林鴻宣課題組贈(zèng)送)中，即得RNA干擾載體P挪一 fSDG708i~ PDK intron —rSDG708i (以下簡(jiǎn)寫(xiě)為 pHB_708Ri)。
[0028]二、反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻植株
參照Hiei等(Plant Mol B1l，1997，35:205 — 218)的方法轉(zhuǎn)化水稻。將質(zhì)粒/7挪通過(guò)電激法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性克隆。將攜帶質(zhì)粒/7挪的農(nóng)桿菌H1105接種到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中28°C搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期，再1:100擴(kuò)大培養(yǎng)到0D_為0.5左右。將菌體重懸于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中。按常規(guī)方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)感染、抗性培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)基上分化得到潮霉素抗性的陽(yáng)性苗。待小苗長(zhǎng)至1cm左右時(shí)，將小苗移至室外網(wǎng)室種植，收種即得Tl代種子。為了進(jìn)一步確定該轉(zhuǎn)基因性狀的穩(wěn)定遺傳，將后來(lái)得到得T2代種子在室外網(wǎng)室種植，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)RNA干擾載體的水稻708R1-m目比野生型水稻(WT )均表現(xiàn)出明顯的晚花表型。
[0029]三、熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)反義5ZW7仍基因水稻中5ZW7仍韻表達(dá)
在相同條件下對(duì)轉(zhuǎn)反義5ZW7仍基因水稻和野生型水稻進(jìn)行培育。按實(shí)施例1中相同方法提取水稻總RNA并且反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)反義SDG708m因水稻和野生型水稻中SDG70_表達(dá)情況。檢測(cè)SDG70m\用引物為:5 ’ 一AAGCCAATATGCTGCGACAA — 3’ (SEQ ID No: 13)，5’一 CCAAAAGGCCCCATCCA — 3’ (SEQ IDNo: 14)。結(jié)果如圖3所示，相對(duì)于野生型水稻，表達(dá)在轉(zhuǎn)反義因水稻708Ri~m中呈現(xiàn)明顯的下降，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)反義5ZW7仍基因水稻的表型缺陷是由于表達(dá)下降而引起的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于來(lái)源于水稻，名稱為SDG708，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì):(1)SEQ ID No:1; (2)將SEQID No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至五十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)利要求1所述的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。3.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是下述核苷酸序列之一: (1)SEQID No:2的核苷酸序列； (2)編碼SEQID No:1蛋白質(zhì)序列的DNA ; (3)與SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。4.含有權(quán)利要求2或3所述的水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體。5.含有權(quán)利要求2或3所述的水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述的水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因中任一片段的引物對(duì)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的引物對(duì)，其特征在于為SEQID No:3和SEQ ID No:4。8.權(quán)利要求2或3所述的水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，得到具有晚花表型的水稻。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是下述氨基酸殘基序列之一：序列表中的SEQ ID No：1；將序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至五十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌以及擴(kuò)增該基因中任一片段的引物對(duì)。該水稻組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因的反義轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)出晚花表型。本發(fā)明為植物品種改良提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
【IPC分類】A01H5/00, C12N9/10, C12N15/82, C12N15/54, C12N5/10, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104911157
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510360749
【發(fā)明人】董愛(ài)武, 俞瑜, 劉兵, 石金磊, 金菁
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月26日