一種抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體和雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)生抗破傷風(fēng)類毒素特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體 和在吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和偶聯(lián)疫苗研發(fā)和質(zhì)量控制上的應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 破傷風(fēng)是一種由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌（Clostridium tetani)引起的高度致死性 疾病，主要發(fā)生于發(fā)展中國家，全世界每年死亡80至100萬人，其中新生嬰兒破傷風(fēng)死亡50 萬人。破傷風(fēng)的預(yù)防主要通過主動免疫（破傷風(fēng)疫苗）或被動免疫（破傷風(fēng)特異性免疫球 蛋白）實現(xiàn)。破傷風(fēng)疫苗由破傷風(fēng)類毒素 （tetanus t〇X〇id，TT)制成，TT是一種經(jīng)過脫毒 處理的類毒素，接種后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。已上市的包含破傷風(fēng)類毒素組分的疫 苗主要有單價破傷風(fēng)疫苗，百日咳-白喉-破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗多聯(lián)疫苗。另外，破傷風(fēng)類毒素 作為應(yīng)用最廣泛的載體蛋白被用于b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、流腦多糖蛋白偶聯(lián)疫苗、 肺炎多糖蛋白偶聯(lián)疫苗中，預(yù)防嬰幼兒多發(fā)的流行性腦膜炎、肺炎等疾病。以解決因嬰幼兒 的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，單純的多糖抗原難以激發(fā)其產(chǎn)生足夠的抗體免疫反應(yīng)的不足。
[0004] 無論是破傷風(fēng)疫苗、百白破聯(lián)合疫苗還是以破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白的多糖蛋 白偶聯(lián)疫苗，在其研宄和生產(chǎn)過程中，均需要準(zhǔn)確測定破傷風(fēng)類毒素蛋白的含量，用于指導(dǎo) 工藝開發(fā)和疫苗質(zhì)量控制。在現(xiàn)行的2010版藥典中，此關(guān)鍵指標(biāo)測定主要依賴于蛋白含 量測定方法（Lowry法）和絮狀單位測定法。Lowry法是一種常用的蛋白濃度檢測法，僅能 測定樣品中總蛋白的含量，對于成分復(fù)雜的樣品不能準(zhǔn)確區(qū)分出破傷風(fēng)類毒素蛋白和準(zhǔn)確 反映蛋白的抗原性，且操作相對復(fù)雜，檢測結(jié)果受實驗操作的影響較大，對溶液配制等有較 高的要求，還會受到多種離子的干擾，難以做到高通量，檢測靈敏度一般為微克（μ g)級。 而絮狀單位測定法雖部分解決了待測樣品抗原性測定的不足，但絮狀單位測定法以Lf單 位濃度為標(biāo)準(zhǔn)。Lf單位是一個相對的效價單位，而非質(zhì)量單位且屬于半定量測定方法，人 為因素對結(jié)果的判定干擾較大，檢測靈敏度也為微克（μ g)級。同時，此方法中待測樣品中 可能存在的其它抗體也會干擾檢測結(jié)果，這給疫苗研發(fā)過程質(zhì)量控制帶來了不確定性。因 此，開發(fā)一種高特異性、高敏感性、高通量的檢測方法對疫苗的研制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制具有重 要意義。
[0005] 單克隆抗體技術(shù)首先由德國科學(xué)家Kholer和英國科學(xué)家Melstein(1975)利用 雜交瘤技術(shù)將產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合，成功的建立了單克隆抗體制備技 術(shù)。該技術(shù)制備的抗體是由識別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，故稱之 為單克隆抗體。本發(fā)明應(yīng)用單克隆抗體制備技術(shù)，成功篩選出能分泌目標(biāo)單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株，該單抗不受檢品中非目標(biāo)蛋白的干擾，可特異性地與吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合 疫苗、b性流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、流腦偶聯(lián)疫苗等疫苗中的破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，解決上述 疫苗中常規(guī)檢測方法和應(yīng)用中的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種能產(chǎn)生識別破傷風(fēng)類毒素特異性強(qiáng)、在檢測破傷風(fēng)類毒素 應(yīng)用中靈敏度特別高的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、及其單克隆抗體和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 1. -種分泌特異性結(jié)合破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05， 其保藏號為 CCTCC NO :C2014200。
[0009] 2.抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體是由技術(shù)方案1所述的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05 分泌產(chǎn)生。
[0010] 3.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在進(jìn)行破傷風(fēng)類毒素特異性 檢測的應(yīng)用。
[0011] 4.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫 苗中檢測破傷風(fēng)類毒素含量的應(yīng)用。
[0012] 5.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在以破傷風(fēng)類毒素為載體的 偶聯(lián)疫苗中檢測破傷風(fēng)類毒素含量的應(yīng)用。
[0013] 6.技術(shù)方案5所述的應(yīng)用，所述的偶聯(lián)疫苗為b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗或流腦 偶聯(lián)疫苗。
[0014] 本發(fā)明所提供的一種分泌特異性結(jié)合破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株WV-TT-05,已于2014年11月26日（保藏日）保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)， 保藏號為：CCTCC NO :C2014200。該保藏中心的地址是：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編： 430072,電話：（027) 68752319,傳真：（027) 6875483,該雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05的存活性于 該保藏中心2014年12月3日檢測為存活。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明分離篩選出了一種在含有破傷風(fēng)類毒素等復(fù)雜成分的聯(lián)合疫苗或偶聯(lián)疫 苗中，能有效排除其它蛋白的干擾，與其它可能同時存在的非目標(biāo)蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)，能 有效避免樣本中其它物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，特異性特別強(qiáng)地、精確定量檢測出破傷風(fēng)類 毒素含量、檢測靈敏度高達(dá)到納克（ng)級別的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體。
[0017] 本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05通過細(xì)胞培養(yǎng)上清效價不低于1 :32000， 小鼠腹水制備的單克隆抗體效價不低于1 :100000,因此，本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05能 夠穩(wěn)定地產(chǎn)生具有上述特性且性能優(yōu)異、高質(zhì)量的抗破傷風(fēng)類毒素單克隆抗體。
[0018] 本發(fā)明所述一種抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在含有破傷風(fēng)類毒素等復(fù)雜成分 的聯(lián)合疫苗或偶聯(lián)疫苗中的破傷風(fēng)類毒素特異性檢測的應(yīng)用中，比現(xiàn)行中國藥典2010版 中常規(guī)的蛋白含量測定方法（Lowry法）和半定量測定的絮狀單位檢測的微克（yg)級更 敏感，提高了檢測的靈敏度，且操作簡單，更適用于含有破傷風(fēng)類毒素等復(fù)雜成分的疫苗開 發(fā)過程中的破傷風(fēng)類毒素的質(zhì)量檢測和控制。
【附圖說明】
[0019] 圖1是破傷風(fēng)類毒素封閉酶聯(lián)免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)是TT標(biāo)準(zhǔn)品的6個稀 釋度，取常用對數(shù)后繪制而成，記為lgTT。縱坐標(biāo)為TT標(biāo)準(zhǔn)品的6個稀釋度在450nm波長 時的吸光值記為A 45tl.
【具體實施方式】
[0020] 以下各實施例無特殊說明均為常規(guī)技術(shù)，各實施例中各種試劑、原料等均為市售 產(chǎn)品。以下各實施例用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 實施例1 :雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05的制備
[0022] 1.1抗原的來源
[0023] 破傷風(fēng)類毒素抗原標(biāo)準(zhǔn)品（TT標(biāo)準(zhǔn)品）購自中國食品藥品檢定研宄院，其余三個 批號破傷風(fēng)類毒素按照中華人民共和國藥典2010版三部制備獲得。
[0024] 1.2小白鼠來源
[0025] 雌性，6 周齡 BALB/c 鼠，SPF (無特定病原體 Specific pathogen Free, SPF)級， 12~15g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（許可證號：SCXK滇2011-0004)。
[0026] 1. 3骨髓瘤細(xì)胞的來源
[0027] 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫 (KCB92021YJ)。
[0028] 1.4雜交瘤細(xì)胞株的制備
[0029] 采用體內(nèi)免疫方式和聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG)融合方法制備單克隆 細(xì)胞。
[0030] 1. 4. 1小鼠免疫及血清效價檢測
[0031] 以50 μ 1 (含20 μ g)破傷風(fēng)類毒素與50 μ 1福氏完全佐劑充分混合，兩后肢脛前 肌注射BALB/c小鼠，2周后等量抗原與50 μ 1福氏不完全佐劑充分混合進(jìn)行第二次免疫，最 后一次直接注射