一種具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)生菌是寄居于植物體內(nèi)，對植物沒有危害的一類菌，對于植物的生長發(fā)育有著 積極的影響，能夠促進(jìn)寄主植物的生長發(fā)育，增強(qiáng)植物的抗病性等。大量的研宄表明拮抗內(nèi) 生囷能夠有效地防治病害。
[0003] 金線蓮又名鳥人參、金線草、金絲線、金線蕨龍等，蘭科開唇蘭多年生草本植物。金 線蓮是我國傳統(tǒng)的珍稀藥用植物，在民間素有"藥王"美稱，具有較高的藥用和保健價值。近 年來，隨著市場需求的不斷增強(qiáng)，金線蓮人工栽培面積急劇增大，同時金線蓮病害問題也是 日漸凸顯。金線蓮灰霉病作為其主要病害之一，具有發(fā)病迅速，發(fā)病面積大，危害大等特點， 給生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。該病害由半知菌亞門灰葡萄孢屬（Botrytis cinerea)的真菌引侵 染所致，不僅對金線蓮危害嚴(yán)重，也是蔬菜類如番茄、黃瓜、茄子、西萌蘆、生菜、韭菜等蔬菜 的主要病害。目前主要的防治方法主要采用農(nóng)藥防治。農(nóng)藥防治雖然效果顯著，但是化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，減弱施用效果，另外農(nóng)藥殘留也是生產(chǎn)者和消費 者極其關(guān)注的問題，對于作為藥用和保健產(chǎn)品的金線蓮來說，農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響其品質(zhì)，對 于人體的也具有大的危害。那么尋找一種無毒且有效的病害防治方法是目前解決金線蓮病 害問題的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，提供一種具有拮抗活性的 甘蔗內(nèi)生菌。該菌株對金線蓮灰霉病病原菌抑菌率達(dá)到69. 7%，具有強(qiáng)的抑菌效果。對減 少和代替農(nóng)藥的使用具有重要的意義。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌，命名為 伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.)SC63-l，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期 為2015年4月1日，保藏編號為CCTCC No. M2015185,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0007] 所述的具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌可以應(yīng)用于防治金線蓮灰霉病病原菌。
[0008] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：本發(fā)明中的具有拮抗活性的甘蔗 內(nèi)生菌對金線蓮灰霉病病原菌抑菌率達(dá)到69. 7%，具有強(qiáng)的抑菌效果。對減少和代替農(nóng)藥 的使用具有重要的意義。所獲得的菌株可以應(yīng)用于防治金線蓮灰霉病病原菌。與傳統(tǒng)的農(nóng) 藥防治方法相比較，利用內(nèi)生菌防治具有無毒性殘留的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0009] 圖1是實施例中內(nèi)生菌與病原菌拮抗效果圖；
[0010] 圖2是實施例中不同用量的SC63-1發(fā)酵液對灰霉病病原菌的抑制效果圖；
[0011] 圖3是實施例中不同用量的SC63-1發(fā)酵液對灰霉病病原菌的抑制曲線圖；
[0012] 圖4是實施例中受抑制菌絲生長狀態(tài)的顯微鏡觀察圖，其中：a、b為生長正常菌絲 的顯微鏡觀察圖；b、d為生長受抑制菌絲的顯微鏡觀察圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0014] 實施例
[0015] 內(nèi)生菌的分離：
[0016] 從某省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地甘蔗苗圃采集兩年宿根的成熟甘蔗3-4根，利用牛肉 膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行分離，并進(jìn)行2-3次純化后，共分離到細(xì)菌60株不同的細(xì)菌菌株；然后 進(jìn)行平板拮抗實驗，得到一株對金線蓮灰霉病病原菌具有強(qiáng)的拮抗作用的菌株。通過擴(kuò)增 其16S rDNA測序驗證屬于伯克霍爾德氏菌。
[0017] 分離步驟：
[0018] 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA)
[0019] 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，酵母浸出液，瓊脂粉 13g，H2O 1000ml，PH 7. 0-7. 2、121°C 高壓滅菌20min。
[0020] NA液體培養(yǎng)基：NA固體培養(yǎng)基不加瓊脂粉即可。
[0021] 引物序列：27F(Seq ID No. I) :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG ;
[0022] 1492R(Seq ID No. 2) ：TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；
[0023] 表面消毒方法：75%酒精浸泡30s，滅菌水清洗2-3次，0. 1%升汞浸泡5min，期間 不間斷搖晃，滅菌水沖洗5-6次。
[0024] 蔗汁提取步驟：
[0025] (1)取甘蔗莖部用清水沖洗干凈；
[0026] (2)切取甘蔗莖部近基部3-5節(jié)一段進(jìn)行表面消毒；
[0027] (3)去掉甘蔗表皮及兩端，用滅菌研缽擠壓蔗汁；
[0028] (4)用2ml離心管收集Iml蔗汁。
[0029] 內(nèi)生菌分離：
[0030] (1)將上述Iml蔗汁以10'ΚΓ2……KT7依次稀釋，分別取100 y 1稀釋液均勻涂 布于NA培養(yǎng)基上，各3個重復(fù)。
[0031] (2) 30°C培養(yǎng)2-3d后根據(jù)菌落大小、形態(tài)、色澤等挑取不同的菌株進(jìn)行再次純化。 每個菌株純化2-3次。
[0032] 拮抗實驗：
[0033] 切取0. 5cmX0. 5cm大小培養(yǎng)3-5d的灰霉病病原菌菌塊于NA培養(yǎng)基中部28°C培 養(yǎng)l-2d后，取10 μ 1過夜培養(yǎng)的內(nèi)生菌菌液滴于培養(yǎng)基的邊緣一側(cè)，每個培養(yǎng)皿3種內(nèi)生 菌，進(jìn)行對峙培養(yǎng)，每個重復(fù)3次。再次培養(yǎng)3-5d后進(jìn)行結(jié)果觀察，獲得一株對金線蓮灰霉 病病原菌具有強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生菌（SC63-1)。經(jīng)16S rDNA測序比對，該菌與伯克霍爾德氏 菌（Burkholderia)相似性為 99. 99%。
[0034] 其中 SC63-116S RDNA 序列（Seq ID No. 3)如下：
[0036] SC63-1抑菌效果測定：
[0037] 為了進(jìn)一步驗證SC63-1的拮抗作用，再次將SC63-1與灰霉病菌進(jìn)行兩點對峙培 養(yǎng)，具體操作如下：切取培養(yǎng)3-4d的灰霉病病原菌菌絲塊置于PDA平板中部，28°C培養(yǎng)2d， 再在PDA培養(yǎng)基距離邊緣Icm處滴10 μ 1過夜培養(yǎng)的SC63-1菌液，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)5-6d后觀察結(jié)果并計算抑菌率。5個重復(fù)（抑菌率=(菌餅半徑-抑菌半徑）/菌餅 半徑X 100% )。結(jié)果顯示，SC63-1對金線蓮灰霉病病原菌的抑菌率平均達(dá)到69. 7%，最高 為73. 3 %，屬于強(qiáng)抑制（見表1，圖1)。
[0038] SC63-1發(fā)酵液對金線蓮灰霉病的抑菌效果：
[0039] 用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)拮抗菌SC63-1約30個小時左右，OD值達(dá)到0. 7左右。12000rpm 離心10min，吸取上清液，用0. 2 μ m細(xì)菌過濾器過濾上清液。在PDA培養(yǎng)基上分別均勻涂布 200 μ 1，400 μ 1，600 μ 1，800 μ 1，1000 μ 1的上清液，在超凈工作臺吹干后切0· 5cmX0. 5cm 大小的培養(yǎng)了 2-3d的菌絲塊于培養(yǎng)皿中部，置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天定時測定菌落直 徑，結(jié)果如圖3所示，第3天時顯示與對照相比，發(fā)酵液對金線蓮灰霉病菌落的生長有明顯 的抑制作用。
[0040] 表1內(nèi)生菌對病原菌的抑制率
[0041]
[0042] 注：抑菌率=(菌餅半徑-抑菌半徑）/菌餅半徑X 100%
[0043] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0044]
[0045]
【主權(quán)項】
1. 一種具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌，其特征在于：命名為伯克霍爾德氏菌 (Burkholderiasp. )SC63-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2015年4月1 日，保藏編號為CCTCCNo.M2015185,保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。2. 權(quán)利要求1所述的具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌應(yīng)用于防治金線蓮灰霉病病原菌。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌，命名為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)SC63-1，保藏日期為2015年4月1日，保藏編號為CCTCC No.M2015185，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明中的具有拮抗活性的甘蔗內(nèi)生菌對金線蓮灰霉病病原菌抑菌率達(dá)到69.7％，具有強(qiáng)的抑菌效果。對減少和代替農(nóng)藥的使用具有重要的意義。所獲得的菌株可以應(yīng)用于防治金線蓮灰霉病病原菌。與傳統(tǒng)的農(nóng)藥防治方法相比較，利用內(nèi)生菌防治具有無毒性殘留的優(yōu)點。CCTCC NO:M201518520150401
【IPC分類】C12R1/01, C12N1/20, A01P3/00
【公開號】CN104928211
【申請?zhí)枴緾N201510282213
【發(fā)明人】王麗, 曹干, 王繼華
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月27日