一種溫郁金細(xì)菌性枯萎病的致病菌株及分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從溫郁金細(xì)菌性枯萎病植株上分離的一種新的致病菌株和分離方法， 以及由此菌株引起的枯萎病的鑒定方法。 技術(shù)背景
[0002] 郁金（拉丁學(xué)名：Curcuma petiolata)為姜黃屬多年生宿根草本植物。根莖肉質(zhì)， 肥大，黃色；葉基生，葉片長(zhǎng)圓形，穗狀花序圓柱形，蒴果3室?；ㄆ?~6月。郁金味辛、 苦，性寒。歸肝、心、肺經(jīng)，具有行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃、活血止痛、行氣解郁、清心涼 血之用。郁金一般病癥多生用，化痰開(kāi)竅宜礬水炒。烹調(diào)用途：西廚中常添加于芥末中以增 香味。為印度常用的烹飪調(diào)味品。亦為"咖喱粉"原料之一。其主要生長(zhǎng)于向陽(yáng)的濕潤(rùn)田園 或水溝邊，主產(chǎn)于浙江瑞安。具有活血止痛，行氣解郁，清心涼血，利膽退黃之功效?，F(xiàn) 代常用于治療肝炎、高脂血癥、膽囊炎、精神分裂癥、癲癇、腫瘤等。溫郁金是一種具有廣泛 應(yīng)用價(jià)值的植物資源，其根莖中抽提出來(lái)的揮發(fā)油中含有強(qiáng)烈抗癌活性物質(zhì)，如β-欖香 烯具有抗癌的作用。
[0003] 隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)模式的轉(zhuǎn)型，農(nóng)民大量種植溫郁金，但由于土地資源的有限，使 得溫郁金的生產(chǎn)過(guò)程中種植土壤長(zhǎng)期連作，病原菌積累沿著，以及管理模式的粗放，導(dǎo)致溫 郁金生產(chǎn)過(guò)程大量塊莖因不知名的枯萎病害的發(fā)生而腐爛，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因此必須盡快 診斷該病害的病因，探尋防治該枯萎病的防治藥劑及其綜合治理技術(shù)，遏制該病害的擴(kuò)展 蔓延，保障溫郁金生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決溫郁金枯萎病害，本發(fā)明從枯萎病害植株上鑒定了一個(gè)特意的病原菌， 為防止該病找出了病因，為你防治該病的藥劑篩選和開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
[0005] 經(jīng)過(guò)一年來(lái)在溫州種植基地的多次采樣，病情的監(jiān)測(cè)，并對(duì)該病害進(jìn)行了病原分 離、鏡檢、純化培養(yǎng)及rDNA ITS測(cè)序等多項(xiàng)研宄，已鑒定了該病害的病原。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種新的引起溫郁金枯萎病的細(xì)菌菌株，該菌株被保藏在中 國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)碼為CCTCC N〇:M2014489的茄科勞爾 氏菌28-1菌株。
[0007] 另一方面，本發(fā)明提供一種從溫郁金上分離鑒定轉(zhuǎn)化引起溫郁金枯萎病的細(xì)菌菌 株28-1的方法，該方法包括如下步驟：
[0008] (1)切取溫郁金上典型癥狀的病健交界處的少量的發(fā)病組織，經(jīng)表面消毒后在NA 培養(yǎng)基上劃線分離，平板在28°C下培養(yǎng)2天后，挑取代表單菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得多個(gè) 純化培養(yǎng)的單菌落，其中，培養(yǎng)的成分為：牛肉浸膏3g，酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，蔗糖 l〇g，瓊脂17g，加水調(diào)制1L，調(diào)pH至7. 0 ;
[0009] (2)用獲得的被保藏在中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)碼 為CCTCC No:M 2014489的茄科勞爾氏菌28-1菌株對(duì)30盆溫郁金進(jìn)行盆栽致病性鑒定，方 法如下：28-1菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，用無(wú)菌水稀釋至0D600為1.0 ;采用針刺、注射等 方法在植株的莖基部接種，注射菌液的體積為Iml ;接種5-10天后可以看到明顯的病癥；首 先是葉片無(wú)光澤，呈略失水狀，葉脈微變黃，葉緣向葉背卷曲；隨后葉脈明顯黃化，葉肉出現(xiàn) 黃斑，葉片萎焉明顯，最后整個(gè)葉片黃化枯萎，因此該細(xì)菌分離物28-1為溫郁金細(xì)菌性枯 萎病的病原物；塊莖病部初呈水漬狀，黃褐色，表面失去光澤，后逐漸軟化，內(nèi)部充滿灰白色 汁液，表皮破裂后，流出污白色汁液；用無(wú)菌水接種的對(duì)照植株生長(zhǎng)正常。
[0010] 對(duì)于保藏真菌的生物學(xué)特性說(shuō)明
[0011] 該細(xì)菌菌株28-1保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)碼為CCTCC No:M 2014489,地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，拉丁學(xué)名：Ralstonia solanacearum 28-1，中文名稱 為：茄科勞爾氏菌28-1，保藏日期為：2014年10月17日。
[0012] 有益效果
[0013] 本發(fā)明從溫郁金上分離獲得專化引起溫郁金的枯萎病的致病性菌株，該菌株只對(duì) 姜科下的溫郁金致病，而對(duì)其下的其他姜科植物，例如生姜，洋姜。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 一、材料與方法
[0015] I. 1溫郁金細(xì)菌性枯萎病病樣的采集與鏡檢
[0016] 從浙江溫州的溫郁金種植基地采集溫郁金細(xì)菌性枯萎病病葉、塊莖等病樣，放入 保鮮袋中置于4°C冰箱保存，待用；挑選典型癥狀的病莖葉、塊莖，置于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢， 以健康葉莖部組織為對(duì)照。
[0017] 1. 2溫郁金細(xì)菌性枯萎病病原菌的分離與致病性測(cè)定
[0018] 切取典型癥狀的病健交界處的少量發(fā)病組織，經(jīng)表面消毒后在NA培養(yǎng)基（牛肉浸 膏3g，酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，鹿糖10g，瓊脂17g，加水調(diào)制1L，調(diào)pH至7. 0)上劃 線分離，平板在28°C下培養(yǎng)2天后，挑取代表單菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得多個(gè)純化培養(yǎng)的 單菌落。用針刺法將分離物回接至原寄主溫郁金的塊莖，以無(wú)菌水作為對(duì)照，重復(fù)3次。
[0019] 1. 3溫郁金細(xì)菌性枯萎病菌基因組DNA提取及rDNA ITS序列擴(kuò)增
[0020] 溫郁金細(xì)菌性枯萎病菌28-1菌株（多個(gè)菌株種一個(gè)表現(xiàn)典型的菌株）送至上海 生工進(jìn)行菌種鑒定，引物序列見(jiàn)表1，所用的試劑、試劑盒及測(cè)序均由上海生工完成。
[0021] 表1引物序列
[0022]
[0023] 1. 4不同濃度茄科勞爾氏菌對(duì)溫郁金的致病性測(cè)定
[0024] 病原菌分離物28-1對(duì)1-2片葉的溫郁金植株進(jìn)行注射接種，采用的菌液濃度分別 為0D600為0. 5、0. 8、1. 0,注射菌量為lml。以無(wú)菌水為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。
[0025] 1. 5不同茄科勞爾氏菌的寄主?；詼y(cè)定
[0026] 病原菌分離物28-1與姜青枯病菌SC56 (本實(shí)驗(yàn)室分離保存）分別同時(shí)注射接種 1-2片葉的溫郁金和姜小苗莖干，菌液濃度0D600為1. 0,注射菌量為lml，測(cè)定不同病原物 對(duì)不同寄主植物的寄主專化性。以無(wú)菌水為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。
[0027] I. 6發(fā)病率與病情指數(shù)的計(jì)算方法
[0028] 溫郁金細(xì)菌性枯萎病病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：
[0029] 0級(jí)：植株健康，無(wú)病癥，生長(zhǎng)正常；
[0030] 1級(jí)：植株葉片葉緣出現(xiàn)輕微發(fā)黃及失水狀萎蔫；
[0031] 3級(jí)：植株葉片部分葉脈出現(xiàn)黃化，葉片失水狀萎蔫較明顯；
[0032] 5級(jí)：植株萎蔫明顯，有1-2片葉片黃化枯萎；
[0033] 7級(jí)：植株萎蔫，或有3片及3片以上葉片黃化枯萎；
[0034] 9級(jí)：植株萎蔫枯死。
[0035] 發(fā)病率以"Ri"計(jì)，數(shù)值以" ％ "表示，計(jì)算公式：Ri = ni/ntX100(ni:發(fā)病株數(shù)； nt:總株數(shù)）病情指數(shù)以"DI"計(jì)，計(jì)算公式：DI =Σ (deXne)/(ntX3) X100(d。：相應(yīng)病級(jí)； η。：各病級(jí)病株數(shù)；nt:總株數(shù)）。計(jì)算結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。
[0036] 二、結(jié)果與分析
[0037] 2. 1溫郁金細(xì)菌性枯萎病的癥狀
[0038] 4月中下旬溫郁金種姜播種出土后就漸漸開(kāi)始出現(xiàn)病癥，初發(fā)病植株葉片呈輕微 缺水狀萎蔫，失去光澤，葉尖，葉緣或葉脈間微微發(fā)黃；隨著葉片的不斷抽生，發(fā)病葉片不斷 增多，癥狀也不斷加重，上部葉片缺水狀萎蔫明顯，下部葉片的著生角度變大，葉片向葉背 反卷，中脈漸漸黃化，葉緣、葉尖、或葉面隨機(jī)的出現(xiàn)不規(guī)則黃斑；隨著病情加重，葉片黃化 加重加深