生物素化熒光素酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物素化熒光素酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物素化(b1tinylat1n)是指將生物素共價(jià)連接到蛋白質(zhì)、核酸或其它分子上的過(guò)程。由于生物素的分子量不大(分子量為244.31)，生物素化反應(yīng)快速、高效且不易被干擾。生物素化的分子能通過(guò)生物素與鏈霉親和素、親和素互作，且不受高熱、pH、蛋白酶解的影響。生物素與鏈霉親和素、親和素的結(jié)合特異且高效，因此這一互作在生物技術(shù)的許多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。另外，多個(gè)生物素化分子可以發(fā)生交聯(lián)來(lái)形成個(gè)科研人員感興趣的蛋白，同時(shí)允許和多個(gè)鏈霉親和素、親和素、中性親和素蛋白結(jié)合，增加了對(duì)此蛋白的檢測(cè)靈敏度。此外還有大量的生物素化分子的應(yīng)用有待開(kāi)發(fā)。
[0003]熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為Photinus pyrali’的螢火蟲(chóng)體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來(lái)自于熒光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷。沒(méi)有熒光素酶的情況下，熒光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M(jìn)一步加速反應(yīng)。
[0004]熒光素酶被生物素修飾之后就可以同親和素進(jìn)行固相親和作用。生物素與親和素是一對(duì)特異性相當(dāng)高的親和配體，并且具有解離速率慢、不易受干擾等特點(diǎn)。目前，生物素化的手段有化學(xué)修飾和生物修飾，但修飾后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的熒光素酶可應(yīng)用于焦磷酸測(cè)序反應(yīng)中，酶活會(huì)直接影響到測(cè)序反應(yīng)的準(zhǔn)確度，所以急需找到一種可操作性強(qiáng)，產(chǎn)物活性高的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是一種生物素化熒光素酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)使用PBS緩沖液溶解熒光素酶；
(2)活化生物素；
(3)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶，按照生物素與熒光素酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液；
(4)使用PBS緩沖液對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，去除雜質(zhì)和游離生物素；
(5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；
(6)加入保護(hù)劑，冷藏保存。
[0006]所述PBS緩沖液pH值為7.4。
[0007]所述溶解熒光素酶，使熒光素酶濃度為1.5-2mg/mlo
[0008]所述活化生物素使用DCC/NHS和有機(jī)溶劑，生物素、DCC和NHS的摩爾比為2:3: 3，有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。
[0009]所述攪拌溫度為4°C，持續(xù)5小時(shí)以上，優(yōu)選為8小時(shí)。
[0010]所述透析過(guò)程溫度為4°C，持續(xù)12小時(shí)以上，優(yōu)選為18小時(shí)。
[0011]所述透析過(guò)程，PBS緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，PBS緩沖液更換一次以上。
[0012]所述保護(hù)劑含有PBS緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
[0013]所述保護(hù)劑優(yōu)選含有PBS緩沖液、甘氨酸、組氨酸、DTT、EDTA和疊氮鈉。
[0014]本發(fā)明中二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑能夠使生物素和熒光素酶溶解于其中，在其中高效、充分的結(jié)合。制備得到的生物素化熒光素酶，非常適合應(yīng)用于焦磷酸測(cè)序反應(yīng)中，熒光素酶的高活性可確保測(cè)序反應(yīng)的準(zhǔn)確度。在測(cè)序反應(yīng)中，可與焦磷酸酶和ATP硫化酶協(xié)同作用，進(jìn)行通量高、讀長(zhǎng)大的測(cè)序反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.8mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入IL分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.24mol溶于由10ml 二甲基甲酰胺和80ml四氫呋喃混合得到的混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌8小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對(duì)10ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)18小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在6小時(shí)更換一次；
(5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；
(6)加入酶體積2倍的保護(hù)劑，保護(hù)劑含有1mMPBS緩沖液、20%甘氨酸、30%組氨酸、0.15mM DTT,0.08mM EDTA 和 0.06mM 疊氮鈉，冷藏保存。
[0016]實(shí)施例2
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.5mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.22mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌5小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對(duì)80ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)12小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在4小時(shí)更換一次；
(5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；
(6)加入酶體積1.5倍的保護(hù)劑，保護(hù)劑含有1mM PBS緩沖液和0.1mM DTT，冷藏保存。
[0017]實(shí)施例3
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.6mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.25mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌6小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對(duì)90ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)15小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在4小時(shí)和8小時(shí)更換；
(5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；
(6)加入酶體積2倍的保護(hù)劑，保護(hù)劑含有1mMPBS緩沖液、20%甘氨酸、0.2mM甘露醇、0.15mM DTT 和 0.08mM EDTA，冷藏保存。
[0018]實(shí)施例4
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為2mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌7小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對(duì)85ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)13小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在2小時(shí)和9小時(shí)更換；
(5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；
(6)加入與酶等體積的保護(hù)劑，保護(hù)劑含有1mMPBS緩沖液、25%甘氨酸、0.15mM DTT和0.2mM聚乙二醇，冷藏保存。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)使用PBS緩沖液溶解熒光素酶； (2)活化生物素； (3)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶，按照生物素與熒光素酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液； (4)使用PBS緩沖液對(duì)混合溶液進(jìn)行透析，去除雜質(zhì)和游離生物素； (5)使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量； (6)加入保護(hù)劑，冷藏保存。2.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述PBS緩沖液PH值為7.4。3.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述溶解熒光素酶，使熒光素酶濃度為1.5-2mg/ml。4.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述活化生物素使用DCC/NHS和有機(jī)溶劑，生物素、DCC和NHS的摩爾比為2:3: 3，有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。5.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述攪拌溫度為40C，持續(xù)5小時(shí)以上，優(yōu)選為8小時(shí)。6.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述透析過(guò)程溫度為4°C，持續(xù)12小時(shí)以上，優(yōu)選為18小時(shí)。7.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述透析過(guò)程，PBS緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，PBS緩沖液更換一次以上。8.如權(quán)利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述保護(hù)劑含有PBS緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物素化熒光素酶的制備方法。包括以下步驟：（1）使用PBS緩沖液溶解熒光素酶；（2）活化生物素；（3）將活化的生物素溶于混合溶劑中，加入熒光素酶，攪拌；（4）使用PBS緩沖液對(duì)混合溶液進(jìn)行透析（5）使用280nm的吸光度測(cè)定蛋白含量；（6）加入保護(hù)劑，冷藏保存。得到的生物素化熒光素酶生物活性高。
【IPC分類(lèi)】C12N9/02
【公開(kāi)號(hào)】CN104928264
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510417159
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風(fēng)
【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年7月16日