一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米磁性材料領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種納米磁性顆粒，具體為一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫微球技術(shù)(Immunomicrospheres)是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種微球進(jìn)行免疫學(xué)或其他生物學(xué)分析分離等方面應(yīng)用的一項(xiàng)技術(shù)。自1956年Singer將人IgG吸附存聚苯乙烯膠乳顆粒上，首次建立檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠乳凝集試驗(yàn)以來(lái)，免疫微球技術(shù)就以其簡(jiǎn)便，高效，實(shí)用的特點(diǎn)，在免疫學(xué)，微生物學(xué)，生物化學(xué)，分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域嶄露頭角。
[0003]免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres, IMMS)或叫做免疫磁性微珠簡(jiǎn)稱免疫磁珠，作為新型的功能材料近年來(lái)已被廣泛研宄，其在生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了各國(guó)研宄者的高度重視。免疫磁性微球是免疫微球的一種，是指連有抗體或抗原的磁性微球，它通過(guò)表面的抗體或抗原特異地與靶物質(zhì)結(jié)合，從而賦予其磁響應(yīng)性，在特定磁場(chǎng)的作用下，通過(guò)免疫磁性微球可以發(fā)生定向移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)其免疫學(xué)檢測(cè)，分離純化，藥物導(dǎo)向等方面的目的。理想的免疫磁性微球應(yīng)具有靈敏性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好以及分離檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]免疫磁性微球是磁性微球與抗體或抗原結(jié)合的產(chǎn)物。磁性微球的范圍廣泛，包括常用的磁性高分子微球、磁性脂質(zhì)體、磁性膠束等；而磁性脂質(zhì)微球是通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ怪|(zhì)體與無(wú)機(jī)物結(jié)合起來(lái)形成具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球，其表面可比較容易的賦予多種反應(yīng)性功能基團(tuán)，如-0H，-COOH和-順2等，使其具有良好的生物相容性，通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等，然后可在外加磁場(chǎng)中進(jìn)行分離富集。因此，磁性脂質(zhì)微球(劉信等，磁性脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用)在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]但是，目前存在的免疫磁性海藻酸鈉微球還存在許多問(wèn)題。首先，免疫磁性海藻酸鈉微球中抗體接枝率較低、活性較難維持。主要原因?yàn)?，利用磁性海藻酸鈉微球表面存在的活性基團(tuán)進(jìn)行改性，溫度較高，時(shí)間較長(zhǎng)，容易降低抗體的活性。再次，所制備的免疫磁性海藻酸鈉微球普遍穩(wěn)定性不足，容易發(fā)生團(tuán)聚；樣品存放半年后，均容易發(fā)生結(jié)塊。如，博士論文(華中科技大學(xué)，李青，2007年)中的免疫磁性海藻酸鈉微球使用的是反相微乳-包埋的方法，所用的材料包含磁粉，海藻酸鈉和表面活性劑琥鉑酸二異辛脂磺酸鈉。本發(fā)明中免疫磁性海藻酸鈉微球與現(xiàn)有技術(shù)具有本質(zhì)的區(qū)別，具體如下:
(1)成分不同，本發(fā)明免疫磁性微球含有Fe3O4超順磁性納米顆粒，海藻酸鈉，脂質(zhì)體成分(卵磷脂、膽固醇、羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽、DSPE-PEG-抗體)；
(2)制備方法不同，本發(fā)明主要采用脂質(zhì)體的薄膜分散法制備；
(2)免疫微球的種類不同，本發(fā)明的免疫微球?qū)儆谥|(zhì)體類的納米微球，海藻酸鈉和羧甲基殼聚糖十八烷基季銨鹽的加入可提高脂質(zhì)體微球的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種海藻酸鈉免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種海藻酸鈉免疫磁珠，核殼型結(jié)構(gòu)，內(nèi)核為磁性材料Fe3O4，中間層為脂質(zhì)體和海藻酸鈉的混合材料，最外層為包被在中間層上的抗體。
[0007]海藻酸鈉免疫磁珠各層的組成比例如下:
海藻酸鈉:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
脂質(zhì)體:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
磁性材料:質(zhì)量含量為0.0%-50.0% ；
抗體:質(zhì)量含量為0.0%-30.0%。
[0008]所述磁珠的粒徑為10nm-10000nm。
[0009]所述抗體為單克隆抗體。
[0010]所述海藻酸鈉免疫磁珠的成分包括海藻酸鈉、卵磷脂、膽固醇和磁性納米顆粒；其中，海藻酸鈉的質(zhì)量含量為10.0%-60.0%，卵磷脂的質(zhì)量含量為10.0%-30.0%，膽固醇的質(zhì)量含量為5.0%-30.0%，磁性納米顆粒為5.0%-30.0%。
[0011]本發(fā)明海藻酸鈉免疫磁珠的制備方法，包括以下步驟:
(I)使用海藻酸鈉與抗體反應(yīng)制備抗體前體物海藻酸鈉-抗體。
[0012](2)用薄膜分散法制備海藻酸鈉磁性脂質(zhì)體:具體為將卵磷脂、膽固醇和油溶性磁性納米顆?；旌先苡谟拖嗦确轮?，孵育20-60分鐘，放入茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成脂質(zhì)膜；
(3)將形成的脂質(zhì)膜與含有海藻酸鈉和抗體前體物海藻酸鈉-抗體的水溶液混合水化，并超聲，即可得海藻酸鈉免疫磁珠。
[0013]上述步驟(I)中將含有海藻酸鈉的水溶液與單克隆抗體混合，加入縮合劑反應(yīng)
0.5至48小時(shí)，透析除去未反應(yīng)的縮合劑；所述海藻酸鈉與縮合劑的質(zhì)量比為1-5:1-20 ；所述的海藻酸鈉與抗體混合的質(zhì)量比為100:1-20;所述縮合劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N, N’-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶、N-羥基琥珀酰亞胺中的一種或兩種。
[0014]本發(fā)明將磁性脂質(zhì)體與海藻酸鈉復(fù)合制備免疫磁珠的中間層，海藻酸鈉的加入可提高磁性脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，同時(shí)可提供反應(yīng)的官能團(tuán)羧基；在海藻酸鈉免疫磁珠免疫磁珠的抗體修飾過(guò)程中，采用先制備抗體前體物海藻酸鈉一抗體，再與脂質(zhì)成分復(fù)合的方法，前體物的使用可較高的維持抗體的活性。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果:
本發(fā)明海藻酸鈉免疫磁珠具有很好的生物相容性，通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián)，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等，在外加磁場(chǎng)中分離富集迅速，可用于生物材料檢測(cè)和分離純化，在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。如制備的抗-EpCAM抗體修飾的海藻酸鈉免疫磁珠可進(jìn)行外周血中腫瘤(乳腺癌)細(xì)胞的抓捕和富集，然后將富集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫染色分析計(jì)數(shù)，就可以指導(dǎo)臨床進(jìn)行個(gè)體化用藥方案的評(píng)估。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0017]實(shí)施例1制備海藻酸鈉免疫磁珠
(I)將5.0mg海藻酸鈉與1.0mg抗-EpCAM單克隆抗體混合，加入濃度為2.0mg/mL的縮合劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽5.0mL中反應(yīng)24小時(shí)，8000-10000分子量透析袋透析除去未反應(yīng)的縮合劑；凍干后得抗