一種乳鐵蛋白定向免疫磁珠及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種乳鐵蛋白定向免疫磁珠及其制備方法和用途，該定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶聯(lián)到磁珠上，然后用抗乳鐵蛋白的抗體與磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶聯(lián)，然后再利用交聯(lián)劑對結合乳鐵蛋白抗體的蛋白G/蛋白A磁珠進行交聯(lián)，該免疫制備方法充分利用了蛋白G與蛋白A與抗體親和力高以及與抗體的Fc片段特異性結合的特點。主要用于對于糧食、食品、飼料、牛奶、血樣以及其他多種樣本中的乳鐵蛋白的結合和純化?？梢杂糜谌殍F蛋白檢測前樣品前期處理，樣品中乳鐵蛋白檢測以及乳鐵蛋白純化。
【專利說明】
一種乳鐵蛋白定向免疫磁珠及其制備方法和用途
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種乳鐵蛋白的定向免疫磁珠及其制備方法和用途。該定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A與磁珠共價偶聯(lián)，然后將乳鐵蛋白抗體連接到蛋白G或者蛋白A上，再采用交聯(lián)劑進行交聯(lián)，制備成穩(wěn)定的乳鐵蛋白定向免疫磁珠。該磁珠具有特異性強，乳鐵蛋白純化效率高和使用簡便的特點。屬食品藥品生產(chǎn)和檢測領域。
【背景技術】
[0002]乳鐵蛋白(Lacoferrin)是一種相對分子質量約為80KD的糖蛋白，主要存在于乳中，特別在初乳中可達7g/L。不管是人乳還是牛乳，隨著乳汁的成熟，其含量會有所下降。除了作為乳腺組織分泌的非特異性保護蛋白質外，乳鐵蛋白還存在于其他外分泌物中，如淚、汗、唾液、膽汁、胰液和小腸腺液等中。
[0003]乳鐵蛋白是一種天然的抗菌糖蛋白，乳鐵蛋白的特異性的鐵離子結合能力使其對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有抗菌能力。研究證明，天然的乳鐵蛋白具有抗病毒能力，日本國立癌癥中心研究所和京都大學病毒研究所的科研人員經(jīng)過動物實驗和臨床試驗實驗發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白能夠抑制人的免疫缺陷病毒和巨細胞病毒對M幾細胞和成纖維細胞的病變作用。除此之外，天然的乳鐵蛋白還具有抑制流感病毒的活性。乳鐵蛋白還具有抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)作用。因此，乳鐵蛋白被用于食品和藥品等多種領域。
[0004]新生兒的免疫系統(tǒng)約在一歲左右才可以發(fā)育成熟，所以他們對病菌的抵抗力比較弱，在嬰幼兒配方奶粉中添加乳鐵蛋白，可以改變嬰幼兒及孕婦普遍缺鐵的現(xiàn)狀，還可以制成含鐵或補鐵膠囊，以用來提高嬰幼兒及孕婦的造血功能，幫助嬰幼兒構筑起生命的第一道防線。
[0005]針對很多由病毒所引發(fā)的疾病，提高人體自身的免疫力是最好的治療方法，在臨床上一般多采取強化免疫力的支持性間接治療的方法，在治療中補充乳鐵蛋白，能夠增強人體的免疫力，預防病毒性感冒、腸道感染等疾病的發(fā)生。美國食品藥品管理局(FDA)允許將乳鐵蛋白作為食品添加劑應用于運動、功能性食品中，在日本、韓國也允許將乳鐵蛋白作為食品添加劑應用于食品中。在我國，衛(wèi)生部在國家標準《食品添加劑使用衛(wèi)生標準GB2760 一 19966》2004年增補品種中允許在嬰兒配方奶粉中添加乳鐵蛋白，添加量允許范圍為 0.30mg/g — lmg/go
[0006]目前，國內(nèi)外對乳鐵蛋白分離方法的研究比較多，主要有鹽析法、超濾法、色譜法坐寸ο
[0007]超濾法純化乳鐵蛋白，原理是利用不同孔徑的超濾膜，將待分離的樣本進行過濾，分子大小超過改孔徑的就會被截留而小于該孔徑的分子就會被濾掉。超濾法操作簡單，費用相對較低，相對而言比較容易形成工業(yè)化的生產(chǎn)規(guī)模。它的缺點是得到的乳鐵蛋白的純度較低，超濾膜需要經(jīng)常清洗。超濾法只能制備粗提的乳鐵蛋白制品。不能夠得到高純度的乳鐵蛋白。
[0008]鹽析法純化乳鐵蛋白，是利用高濃度的鹽離子使蛋白表面的離子飽和，從而降低其離子間作用使蛋白沉淀。鹽析法所需試劑簡單廉價，且操作比較簡單，成本相對而言要低很多，但是鹽析法分離純化得到的乳鐵蛋白的純度不是很高，適用于保健品和食品添加劑等對乳鐵蛋白的純度要求不高的行業(yè)。
[0009]色譜法也叫層析法，是利用固定基質和吸附質間物理或化學吸附強度的不同來分離物質的一種方法，疏水性的相互作用色譜在乳鐵蛋白的分離上有重要的應用，其缺點是吸附容量比較小，效率比較低。
[0010]離子交換層析是層析法的一種，最早利用DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離純化得到較純的乳鐵蛋白的是Groves爾后他又開發(fā)出了磷酸纖維素交換色譜法Foley等人(島崎敬一黑田青隆.酪農(nóng)科學，食品與研究，1989,38:95)在此法的基礎上加以改進，分離得到的乳鐵蛋白的純度在81%左右。中國專利CN101724013.A公布了一種從牛乳中分離純化乳鐵蛋白的方法就是通過陽離子交換層析與陰離子交換層析結合來得到純度較高的乳鐵蛋白。此外中國專利CN1849903A、CN1663961A和CN101117351A等是通過離子交換層析或者離子交換層析與膜分離技術相結合從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白。此外，美國專利US5149647利用微濾處理與陽離子交換樹脂結合乳清中純化乳鐵蛋白?？傮w來說，離子交換層析能夠處理大量的乳品樣本，并且成本低廉。缺點就是操作比較繁瑣，而且往往得到的乳鐵蛋白純度受到限制。
[0011]親和層析法是一種比較新興的分離技術，利用配體和乳鐵蛋白的親和力進行分離純化。它的一般結構為:不容基質一連接物一隔離臂一連接物一配體?；|一般多用瓊脂多糖，隔離臂一般多是有一定長度的可以連接基質的有機物如NH2-(CH2)n-NH2 (n=6_ll)等。肝素瓊脂糖親和色譜是目前被認為純化乳鐵蛋白最好的親和色譜。它能從乳中一步分離來得到乳鐵蛋白，經(jīng)電泳分析表明其純度很高，可以達到90%以上。中國專利CN1486989A描述了一種肝素瓊脂糖親和柱層析純化乳鐵蛋白的方法。此類親和柱可以簡單的一步純化得到純度較高的乳鐵蛋白，親和柱由于其固有的塔板效應的缺點，在純化時上層的凝膠與乳鐵蛋白較好，但由于凝膠空隙被堵塞的影響，越到柱子的底部與蛋白結合越弱。致使親和層析柱用于大規(guī)模的純化時不能充分發(fā)揮其性能。
[0012]磁珠法的原理類似于親和層析，將親和介質通過化學鍵偶聯(lián)到磁珠上。在純化時將磁珠與原料混合，使配體與親和物發(fā)生反應。利用磁珠能夠與磁鐵結合的特性使磁珠貼壁然后將雜物分離掉。中國專利CN103406101報道了一種利用染料磁珠純化乳鐵蛋白的方法。但相對來說染料與乳鐵蛋白的結合能力遠遠比不上抗原抗體的結合能力與特異性。
[0013]目前市場上常見的定向免疫磁珠都是將抗體直接偶聯(lián)到磁珠表面，但是由于抗體分子較大，偶聯(lián)不受控制，抗體可能以任何方向偶聯(lián)到磁珠上。某些抗體偶聯(lián)方向會導致在抗原分子結合時由于空間位阻的原因無法結合，更有些情況下，抗體的抗原結合區(qū)域偶聯(lián)到磁珠上導致這一抗原結合區(qū)域被封閉掉。由于乳鐵蛋白分子很小，攜帶的抗原表位只有1-2個，一個抗原結合區(qū)域的封閉就可能導致這一分子的抗體失去抗原結合能力。因而會影響到整個定向免疫磁珠的抗原結合效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于提供一種乳鐵蛋白定向免疫磁珠及其制備方法和用途，在本發(fā)明中，我們利用了抗原抗體特異性結合的原理，將乳鐵蛋白抗體通過定向偶聯(lián)，連接到磁珠上，用于純化樣本中的乳鐵蛋白。如果利用乳鐵蛋白的定向免疫磁珠對樣本中的乳鐵蛋白進行純化，只需要將樣本與磁珠混合，磁珠上面的抗體就可以將樣本中的乳鐵蛋白吸附，磁珠利用磁性原理貼壁后，將其余的部分去除，然后再將結合在定向免疫磁珠上面的乳鐵蛋白洗脫下來。不但操作簡單，而且還可以對樣本中的乳鐵蛋白進行富集，可以檢測低含量的樣本。此外，由于完全在液相條件下進行乳鐵蛋白純化，每個磁珠對于乳鐵蛋白的結合能力都是相同的，因而純化效率很高。利用蛋白A或者蛋白G能夠特異性結合抗體恒定區(qū)(Fe區(qū))的特點，通過蛋白A或者蛋白G將抗體固定在磁珠表面，使得抗體的抗原結合區(qū)域(Fab區(qū))全部暴露在外，大大增加了定向免疫磁珠的抗原結合能力。
[0015]為了達到上述目的，在本發(fā)明中，利用了蛋白G或者蛋白A的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fe部位相結合。并且具有很高的親和力。蛋白A是葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白，與蛋白G類似。蛋白A也具有抗體結合能力，也是通過抗體的Fe區(qū)域與抗體結合。微生物來源的蛋白G和蛋白A這一特性與其多年來進化獲得的宿主逃避和自我保護能力密切相關。我們克隆了野生蛋白G和蛋白A的基因序列，并且對其密碼子進行了優(yōu)化、重組后，在大腸桿菌中表達出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G和蛋白A。將基因重組的蛋白G或蛋白A偶聯(lián)到磁珠上后，再將乳鐵蛋白抗體偶聯(lián)到蛋白G或蛋白A上，制備出了乳鐵蛋白一蛋白G/蛋白A—磁珠，再用交聯(lián)劑將載體進行交聯(lián)。就形成了高親和力的乳鐵蛋白定向免疫磁珠。該磁珠操作簡便，純化乳鐵蛋白效率高。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進行純化，得到純度很高的乳鐵蛋白，用于高效液相色譜檢測。
[0016]具體操作如下:
本發(fā)明最大的優(yōu)勢就是利用了蛋白G與蛋白A與Ig抗體特異性結合的特點，IgG抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，抗體分為Fab區(qū)和Fe區(qū)，其中，F(xiàn)ab區(qū)是抗原結合的區(qū)域。
[0017]蛋白G是鏈球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fe區(qū)域有特異性的結合能力。蛋白G與抗體結合后，抗體的Fab區(qū)域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經(jīng)過我們基因優(yōu)化重組后的蛋白G，I個分子的蛋白G可以結合3個分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。
[0018]與蛋白G類似，蛋白A是葡萄球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fe區(qū)域有特異性的結合能力。蛋白A與抗體結合后，抗體的Fab區(qū)域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經(jīng)過我們基因優(yōu)化重組后的蛋白A，I個分子的蛋白G可以結合6個分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。
[0019]以此蛋白G或者蛋白A為基礎制備的定向免疫磁珠具有特異性好,乳鐵蛋白結合量大，純化效率高的特點。
[0020]乳鐵蛋白定向免疫磁珠及其制備方法說明如下:
1.將磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0021]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)至終濃度5_20mg/ml，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS)至終濃度10_25mg/ml。
[0022]3.室溫反應15-60分鐘。
[0023]4.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在50mM PH6.0的MES緩沖液中。
[0024]5.將蛋白G或者蛋白A加入重懸后的磁珠中，使蛋白量與磁珠表面配基的摩爾比達到 5-10:1。
[0025]6.室溫反應2-4小時。
[0026]7.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0027]8.反應后的磁珠用IM的乙醇胺室溫封閉。
[0028]9.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0029]10.在磁珠中加入抗乳鐵蛋白抗體，使抗體量與磁珠中蛋白G量摩爾比達到3-5:1.11.將加入抗體的磁珠在37°C反應10-40分鐘.12.磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在IM PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0030]13.將乳鐵蛋白抗體一蛋白G/蛋白A—磁珠載體加入終濃度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室溫反應1_2小時。
[0031]14.用50mM PH9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌乳鐵蛋白抗體一蛋白G/蛋白A —磁珠3次。
[0032]15.將磁珠重懸在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中。放于4°C保存。
[0033]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1.充分的利用了蛋白G與蛋白A與IgG抗體特異性結合的特性，使抗體通過蛋白G/蛋白A偶聯(lián)到載體上。并且IgG抗體的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了乳鐵蛋白的捕捉能力，乳鐵蛋白的純化效率也得到有效提聞。
[0034]2.本發(fā)明使用了基因改造后的蛋白G和蛋白A，通過對密碼子的優(yōu)化和IgG結合域基因的優(yōu)化。使蛋白G和蛋白A的抗體結合能力大幅度提聞，進而提聞了乳鐵蛋白的純化效率。
[0035]3.使用本發(fā)明純化乳鐵蛋白操作簡便，更方便操作者使用。
[0036]4.使用本發(fā)明得到的乳鐵蛋白純度高，可直接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測，節(jié)省了操作時間和費用。
【附圖說明】
[0037]圖1、蛋白G偶聯(lián)的乳鐵蛋白定向免疫磁珠結構示意圖。
[0038]圖2:奶粉樣本中乳鐵蛋白含量檢測HPLC圖譜。
[0039]其中，A:磁珠，B:蛋白G, C:乳鐵蛋白抗體。
實施例
[0040]實施例1:利用基因重組蛋白G制備乳鐵蛋白定向免疫磁珠本發(fā)明制備乳鐵蛋白定向免疫磁珠的一個優(yōu)選的實施方案如下:
1.磁珠活化
取5mg羧基修飾的納米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液洗滌3次，然后將磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0041]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS) 10mg,室溫反應15分鐘。
[0042]3.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在5ml 50mMPH6.0的MES緩沖液中。
[0043]4.在磁珠中加入20mg蛋白G，室溫反應4小時。
[0044]5.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0045]6.反應后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室溫封閉2小時。
[0046]7.磁珠用50ml 20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在5ml 20mM PBSPH7.4緩沖液中。
[0047]8.在磁珠中加入200mg抗乳鐵蛋白抗體，將加入抗體的磁珠在37°C反應30分鐘。
[0048]9.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0049]10.磁珠用0.1M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在5ml 0.1M硼PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0050]11.稱取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含乳鐵蛋白抗體一蛋白G—磁珠的PBS緩沖液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至調(diào)PH8.3.室溫反應I小時。
[0051]12.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺終止反應。
[0052]13.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌乳鐵蛋白抗體一蛋白G —磁珠3次。然后將磁珠重懸在5ml的該緩沖液中，放于4°C保存。
[0053]實施例2:利用基因重組蛋白A制備乳鐵蛋白定向免疫磁珠本發(fā)明制備乳鐵蛋白定向免疫磁珠的一個優(yōu)選的實施方案如下:
1.磁珠活化。
[0054]2.取5mg羧基修飾的納米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液洗滌3次，然后將磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0055]3.在磁珠中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS) 10mg,室溫反應20分鐘。
[0056]4.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在5ml 50mMPH6.0的MES緩沖液中。
[0057]5.在磁珠中加入30mg蛋白A,室溫反應4小時。
[0058]6.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0059]7.反應后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室溫封閉2小時。
[0060]8.磁珠用50ml 20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在5ml 20mM PBSPH7.4緩沖液中。
[0061]9.在磁珠中加入300mg抗乳鐵蛋白抗體，將加入抗體的磁珠在37°C反應30分鐘。
[0062]10.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0063]11.磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在5ml 0.1 M硼PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0064]12.稱取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含乳鐵蛋白抗體一蛋白A—磁珠的PBS緩沖液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至調(diào)PH8.3.室溫反應I小時。
[0065]13.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺終止反應。
[0066]14.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌乳鐵蛋白抗體一蛋白A —磁珠3次。然后將磁珠重懸在5ml的該緩沖液中，放于4°C保存。
[0067]實施例3:利用蛋白G偶聯(lián)的乳鐵蛋白定向免疫磁珠純化脫脂奶粉中的乳鐵蛋白
1.取1g脫脂奶粉加入50mL20mM PH7.4 PBS緩沖液溶液混勻；
2.在奶粉溶液中加入IMHCl調(diào)節(jié)至PH值4.6使酪蛋白沉淀。
[0068]3.4°C條件下12000r離心離心20分鐘，取上清。
[0069]4.加入 IM NaOH 調(diào)節(jié) PH 至 7.4。
[0070]5.加入lmg/ml蛋白G偶聯(lián)的乳鐵蛋白定向免疫磁珠1ml,混勻后室溫放置30分鐘。
[0071]6.將反應后的磁珠混合液放到磁力架上2分鐘，待磁珠貼壁。用吸管去掉其余的緩沖液。
[0072]7.在磁珠中加入50ml 20mM PH7.4 PBS洗滌磁珠，然后將磁珠放入磁力架中待磁珠貼壁后，用吸管去除緩沖液。
[0073]8.重復洗滌步驟3次。
[0074]9.在磁珠中加入5ml 0.1M PH3.0的甘氨酸緩沖液，混勻。使磁珠上的乳鐵蛋白洗脫下來。
[0075]10.將磁珠放入磁力架中使磁珠貼壁，將洗脫的緩沖液取出到另一試管中，馬上加入500ul PH9.0 IM Tris緩沖液，充分混合。
[0076]11.洗脫后的緩沖液用高效液相色譜(HPLC)檢測其含量。
[0077]12.高效液相色譜檢測結果如圖2所示，根據(jù)HPLC檢測圖譜可以得出該奶粉樣本中乳鐵蛋白含量為100PPM。
【主權項】
1.一種乳鐵蛋白的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠載體、蛋白G或者蛋白A和乳鐵蛋白抗體。2.根據(jù)權利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通過共價鍵偶聯(lián)在載體上，乳鐵蛋白抗體與蛋白G結合，用交聯(lián)劑交聯(lián)，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-乳鐵蛋白抗體偶聯(lián)載體。3.根據(jù)權利要求1中所述的乳鐵蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重組表達的蛋白G。4.根據(jù)權利要求1中所述的乳鐵蛋白定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重組表達的蛋白A。5.根據(jù)權利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列I表達的蛋白G，以及經(jīng)過序列優(yōu)化后表達的蛋白G。6.根據(jù)權利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表達的蛋白A，以及經(jīng)過序列優(yōu)化后表達的蛋白A。7.根據(jù)權利要求1中所述的載體，包括納米磁珠以及直徑超過Iμ m的普通磁珠。8.根據(jù)權利要求2中所述的抗乳鐵蛋白抗體，其特征在于包括單克隆IgG抗體和多克隆抗體。9.一種純化乳鐵蛋白的定向免疫磁珠制備方法，其特征在于: 1)將磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起； 2)在磁珠中加入EDC至終濃度5-20mg/ml，再加入Sulfo-NHS至終濃度10_25mg/ml； 室溫反應15-60分鐘； 3)反應后的磁珠用50mMMES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在50mM PH6.0的MES緩沖液中； 4)將蛋白G或者蛋白A加入重懸后的磁珠中，使蛋白量與磁珠表面配基的摩爾比達到5-10:1 ； 5)室溫反應2-4小時； 6)反應后的磁珠用50mMMES緩沖液PH6.0洗滌3次； 7)反應后的磁珠用IM的乙醇胺室溫封閉； 8)磁珠用20mMPBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中； 9)在磁珠中加入抗乳鐵蛋白抗體，使抗體量與磁珠中蛋白G量摩爾比達到3-5:1; 10)將加入抗體的磁珠在37°C反應10-40分鐘； 11)磁珠用0.1M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在IM PH9.0的硼酸緩沖液中； 12)將乳鐵蛋白抗體一蛋白G/蛋白A—磁珠載體加入終濃度0.2M的三乙醇胺和20mM的DMP，PH8.3.室溫反應1-2小時； 13)用50mMPH9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01%硫柳汞的1mM PBS PH7.4洗滌乳14)鐵蛋白抗體一蛋白G/蛋白A —磁珠3次； 15)將磁珠重懸在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中，放于4°C保存。10.一種乳鐵蛋白的定向免疫磁珠，其用于包括糧食、飼料、牛奶及乳制品、水產(chǎn)、血液、尿液、水中乳鐵蛋白的分離純化，純化后的乳鐵蛋白可以用于高效液相色譜及其它方法檢 bo fiV/TL
【文檔編號】G01N33/553GK105842456SQ201510016971
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月14日
【發(fā)明人】張彥明, 柳家鵬
【申請人】北京康諾生物科技有限公司