生型131101^3誘導(dǎo)產(chǎn)量相比較，也有明顯的下降。在樣品濃度 為lOOng/ml時(shí)，BWOOl產(chǎn)生的特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-單磷酸類脂A誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8為14782. 5pg/ ml，而野生型W31IOLPS誘導(dǎo)產(chǎn)生了 19347. 3pg/ml?；蚬こ叹鶥WOOl產(chǎn)生的Kdo2-單磷酸 類脂A與野生型W3110LPS刺激人細(xì)胞THP-I后產(chǎn)生的TNF-a較小鼠細(xì)胞RAW264. 7低一 個(gè)數(shù)量級(jí)，但趨勢(shì)與IL-8基本一致。此結(jié)果表明，基因工程菌BWOOl產(chǎn)生的Kdo2-類脂A對(duì) 人細(xì)胞的刺激毒性也明顯的減弱，也適宜應(yīng)用于后續(xù)人的疫苗佐劑的開發(fā)。
[0045] 實(shí)施例3低毒的Kdo2-單磷酸類脂A生產(chǎn)基因工程菌BWOOl疏水性和自凝集能力 分析
[0046] 1、基因工程菌BWOOl和野生型大腸桿菌W3110疏水性的比較
[0047] 菌株疏水性測(cè)定方法為：過夜培養(yǎng)菌液離心（7000g，IOmin)收集菌體；菌體用 PBS7. 4洗2次；然后用PBS7. 4懸浮菌體使0D6。。=I. 0 (記為A。，保留3位小數(shù)）；最后將 2mL菌懸液與800yL二甲苯混合，混旋2min，室溫靜置Ih后測(cè)定水相的ODm。（記為A，保留 3位小數(shù)），計(jì)算細(xì)胞表面疏水性：H% = (VA)從*100。
[0048] 由于LPS是大腸桿菌外膜表面的主要大分子，waaCF敲除后，LPS親水性外核心多 糖鏈的缺失會(huì)使細(xì)胞表面疏水性增強(qiáng)（圖5A)。經(jīng)測(cè)定，野生型大腸桿菌W3110的疏水性 為39.6%，而工程菌BWOOl的疏水性明顯上升至82.8%，約為野生型的2倍左右。已有文 獻(xiàn)證明，菌株自凝集性與細(xì)胞表面疏水性正相關(guān)（r= 0. 71)，較強(qiáng)的細(xì)胞表面疏水性有利 于增強(qiáng)細(xì)胞之間的疏水相互作用，使細(xì)胞在水溶液中較易凝集而沉降下來。
[0049] 2、基因工程菌BWOOl和野生型大腸桿菌W3110自凝集能力的比較
[0050] 菌株自凝集能力測(cè)定方法為：離心（7000g，5min)過夜培養(yǎng)菌液以收集菌體， PBS7. 4洗菌體2次；然后用PBS7. 4懸浮菌體使0D6。。= 2. 0 (記為A。，保留3位小數(shù)）；取12mL 該菌液加入試管或者刻度管中，于22°C靜置；分別測(cè)定Oh、I. 5h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、 24h的0D6。。值（記為A;，保留3位小數(shù)）；計(jì)算自凝集百分?jǐn)?shù)AAg% = [ (AtJ-Ai) /A。]X100。 AAg%越大表明菌體的自凝集能力越強(qiáng)。繪制曲線表明自凝集能力大小隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。 [0051 ] 如圖5B，靜置6小時(shí)后BW001自凝集百分?jǐn)?shù)明顯高于W3110，靜置12小時(shí)后，BW001 與W3110的自凝集百分?jǐn)?shù)分別為72. 6%和17. 7%，BW001自凝集能力較野生型高出三倍。 菌體自凝集強(qiáng)的菌株在工業(yè)生產(chǎn)中更加有利于被迅速收集，增加生產(chǎn)效率。
[0052] 實(shí)施例4低毒的Kdo2-單磷酸類脂A生產(chǎn)基因工程菌BW001抗生素抗性分析
[0053] 細(xì)菌外膜作為天然屏障，在抵御抗生素進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。LPS結(jié)構(gòu)變化 后，考慮到工程菌株實(shí)際生產(chǎn)使用時(shí)的安全性，采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定基因工程菌 株和野生型大腸桿菌對(duì)紅霉素和新生霉素的最小抑菌濃度（MIC)。紅霉素（Erythromycin) 是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可與23SrRNA的特異性區(qū)域結(jié)合，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)破壞效應(yīng)，使肽酰tRNA從 核糖體上較早的解離，從而影響肽鏈的生成和延長(zhǎng)；新生霉素（Novobiocin)是香豆素類抗 生素，可以抑制DNA聚合酶。影響核酸代謝。
[0054] MIC測(cè)定方法為：抗生素用LB液體培養(yǎng)基稀釋，將倍比稀釋的紅霉素和新生霉素 加到96孔板中，每孔加100yL，其中紅霉素濃度梯度為500、250、125、62. 5、31. 3、15. 6、 7. 8、3. 9yg/mL，新生霉素濃度梯度為 1000、500、250、125、62. 5、31. 3、15. 6、7. 8yg/mL，最 后一孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照。
[0055] 測(cè)定結(jié)果顯示，基因工程菌株BW001對(duì)紅霉素（Erythromycin)和新生霉素 (Novobiocin)的敏感性基本一致，抗性均非常低。紅霉素對(duì)W3110與BW001菌株的MIC分別 為 125yg/mL、7. 8yg/mL;新生霉素對(duì)W3110 與BW001 菌株MIC分別為 500yg/mL、31. 3yg/ mL。BW001菌株對(duì)紅霉素和新生霉素的敏感性明顯增強(qiáng)，均降低到約為野生型的1/16,說明 缺失為核心多糖和Cl位磷酸基團(tuán)后，細(xì)胞外膜滲透性有一定程度的提高從而抗生素更容 易進(jìn)入細(xì)胞。總而言之，對(duì)抗生素的高敏感性和低抗性表明基因工程菌株BW001是非常安 全可控的工業(yè)生產(chǎn)菌株。
[0056] 本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌株能直接生產(chǎn)特殊結(jié)構(gòu)、低毒Kdo2-單磷酸類脂A，避免 了使用致病菌生產(chǎn)LPS或類脂A，同時(shí)避免的苯酚的使用和繁瑣的化學(xué)水解、層析，菌株自 身無抗生素篩選標(biāo)記并顯示較高抗生素敏感性和較高的自凝集能力，更有利于安全的、綠 色的、大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0057] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型低毒的Kdo 2-單磷酸類脂A，其特征在于，化學(xué)式為C1iqH2qiN2O36P,結(jié)構(gòu)包含 2個(gè)a -酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸、2個(gè)氨基葡萄糖、1個(gè)磷酸基團(tuán)和6條脂肪酸鏈，是以 0 _(1' -6)連接的D-葡萄糖胺二糖為骨架，6'位連接二a -酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸、 4'位被磷酸化、3'位連接（R)-3-(十四烷氧基）十四烷基、2'位氨基連接（R)-3-(十二烷 氧基）十四烷基、3位和2位氨基分別連接十四烷氧基而構(gòu)成。2. -種產(chǎn)新型低毒的Kdo 2-單磷酸類脂A的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述基 因工程菌的基因型為 E.coli W3110 AwaaCF A IacI IacZ: :FnlpxE。3. -種構(gòu)建權(quán)利要求2所述的大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 將人工構(gòu)建的IacI敲除片段轉(zhuǎn)化入E. coli W3110/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，獲得突變 株E. coli W3110 lacI::Pkan，通過Cre酶介導(dǎo)的IoxP位點(diǎn)特異性重組去除卡那霉素抗性 基因； 2. FnlpxE片段電轉(zhuǎn)入步驟1)制備的E. coli W3110 A lacI/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，獲得 重組菌，其基因型為E. coli W311〇AlacI lacZ::FnlpxE_Fkan，通過FLP酶介導(dǎo)的FRT位 點(diǎn)的特異性重組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，構(gòu)建成中間菌株HffOOl ; 3) 在HffOOl的基礎(chǔ)上將人工構(gòu)建的waaCF敲除片段轉(zhuǎn)化入HW001/pKD46感受態(tài)細(xì) 胞中，獲得重組菌E. coli HW001waaCF:Pkan，再次通過FLP酶介導(dǎo)的FRT位點(diǎn)的特異性重 組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，最終基因型分別為E. coli W3110 A waaCF A IacI IacZ: :FnlpxE，構(gòu)建成基因工程菌株BWOOl。4. 一種應(yīng)用權(quán)利要求2所述大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)低毒Kdo 2-單磷酸類脂A的方 法，其特征在于，包括三個(gè)主要步驟，（1)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)菌體，（2)收集菌體，Bligh-Dyer混 合體系提取分離減毒Kdo 2-類脂，（3)DEAE纖維柱純化Kdo2-類脂。5. 權(quán)利要求1所述減毒Kdo 2-單磷酸類脂A的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述減毒Kdo 2-單磷酸類脂A在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述大腸桿菌基因工程菌在在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型低毒的Kdo2-類脂A的制備及其應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明改造大腸桿菌，合成了一種具有特殊結(jié)構(gòu)、低毒的Kdo2-單磷酸類脂A，這種Kdo2-類脂A不含外核心多糖長(zhǎng)鏈、僅由兩個(gè)2-酮-3-脫氧辛酸、六條脂肪酸鏈和C4位單磷酸構(gòu)成。該Kdo2-類脂A，便于分離提取和檢測(cè)，且保持了類脂A部分的生物免疫活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是極具發(fā)展?jié)摿Φ囊呙缱魟?。同時(shí)，本發(fā)明提供的提取和純化該Kdo2-類脂A的方法，標(biāo)準(zhǔn)且步驟簡(jiǎn)單明了，易于操作。
【IPC分類】C12P19/12, C12N1/21, A61K39/39, C07H13/06, C12R1/19
【公開號(hào)】CN105001276
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510284792
【發(fā)明人】王小元, 王碧雯, 韓亞寧, 李燁, 李顏顏
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年5月28日