一種類蟲草活性寡糖的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種類蟲草活性寡糖的制備方法與應(yīng)用，屬于功能性膳食纖維制備技術(shù)領(lǐng)城。
【背景技術(shù)】
[0002]蟲草屬麥角菌科真菌，分布地域廣，生活史獨(dú)特，物種多樣，包括蟬花、蛹蟲草、大團(tuán)囊蟲草、高雄山蟲草等，迄今發(fā)現(xiàn)的蟲草物種約400多種，蟲草多糖是蟲草中主要的藥理活性成分之一，具有多種生物活性:
1、抗腫瘤活性:蟲草胞內(nèi)、胞外多糖可以刺激非特異防御系統(tǒng)，通過免疫調(diào)節(jié)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，降低微核率，間接殺傷癌細(xì)胞，對(duì)黑色素瘤、MA-737乳腺癌、艾氏腹水瘤等有抑制作用。
[0003]2、免疫調(diào)節(jié)作用:促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核增殖分化，促進(jìn)免疫活性因子生成，提高血清IgM，IgG水平。蟲草多糖的不同多糖組分均有免疫增強(qiáng)作用。
[0004]3、抗氧化作用:體外清除羥自由基、超氧陰離子，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。
[0005]4、保護(hù)肝臟、腎臟:對(duì)化學(xué)性、免疫性肝損傷、纖維化及慢性腎衰竭等，通過降低脂質(zhì)過氧化，改善組織氧化還原狀態(tài)，降低血清ALT，AST活性和降低肝臟炎性因子，抑制HSC增殖，減輕組織損傷。
[0006]5、降血糖:對(duì)糖尿病有抗衰老作用。
[0007]國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蟲草多糖結(jié)構(gòu)研究表明，在不同品種、生長(zhǎng)環(huán)境(培養(yǎng)條件、產(chǎn)地)及生長(zhǎng)期的差異下蟲草多糖結(jié)構(gòu)、組成均不盡相同。多糖是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多聚體，蟲草屬真菌多糖分子量分布范圍寬，結(jié)構(gòu)上高度分支，且支化度和支鏈的連接方式各有不同，具有微觀不均一性特點(diǎn)。由于多糖是化學(xué)表征最為困難的一類高分子化合物，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)及構(gòu)效研究方面尚存在明顯的缺憾。目前研究表明，蟲草屬真菌的無(wú)性型和假定無(wú)性型與野生蟲草有基本相同的化學(xué)成分和類似藥理作用。同時(shí)，已證實(shí)蟲草多糖主要組分包括葡聚糖、半乳糖、甘露糖、雜多糖及蛋白結(jié)合聚糖等。蟲草多糖分子糖苷鍵鏈接1-3，部分1-6，1-2鏈接具有較好的免疫活性。
[0008]自20世紀(jì)80年代后期，Goldman發(fā)現(xiàn)多糖成分可與單核巨噬細(xì)胞(M )表面的受體結(jié)合，激活M使其分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)免疫功能。這一發(fā)現(xiàn)引起了對(duì)蟲草多糖功能基團(tuán)與活性關(guān)系機(jī)制的思考。盡管糖苷鍵型和單糖連接方式類型對(duì)多糖活性很重要，但單糖組成是影響一級(jí)和空間結(jié)構(gòu)的主要因素，蟲草屬真菌多糖中“活性片段或活性決定簇”，可能是其發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵。這為研究和制備蟲草活性寡糖提供了新的思路和可能性。肖建輝(2005)采用超聲法多糖解聚蟲草多糖鏈，分離出低分子組分，證實(shí)低分子活性片段對(duì)促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬和細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷能力(肖建輝，梁宗琦，胡錫階，等.古尼蟲草多糖及其解聚物的免疫活性[J].免疫學(xué)雜志，2005，21(1): 51- 53.)已在香菇多糖、靈芝多糖等研究中得到證實(shí)功能糖活性片段。Kiyohara等認(rèn)為多糖含半乳糖醛酸聚糖區(qū)和帶中性糖鏈的鼠李、半乳糖醛酸中心具藥理活性，且分支區(qū)與抗補(bǔ)體作用、促進(jìn)有絲分裂。這對(duì)闡明多糖作用機(jī)制和寡糖活性研究具有重要的價(jià)值。
[0009]關(guān)于蟲草多糖制備，目前主要采用水提醇沉法。上世紀(jì)70年代Miyazaki對(duì)蟲草進(jìn)行醇、醚脫脂，熱水浸提，透析、醇沉、蛋白酶消化、sevag法去雜蛋白，凝膠色譜等制備了蟲草多糖；目前，對(duì)水提可采用超聲或微波輔助提取獲得水溶性多糖，然后濃縮(至14%水)，醇沉、去蛋白(蛋白酶消化、sevag法去雜蛋白)，獲得粗多糖CP ;粗多糖CP進(jìn)一步分離純化如膜分離(陶瓷膜，超濾膜10000，5000)，獲得不同分子量糖組分，再將不同膜截留液進(jìn)行真空干燥，進(jìn)一步凝膠色譜分離、干燥。綜上，多糖提取純化過程工序多，廢液廢水量大，并且，多糖產(chǎn)物中雜蛋白去除一直是技術(shù)難點(diǎn)，影響蟲草多糖的純度。
[0010]蟲草寡糖的制備目前多通過將蟲草多糖用物理方法(超聲、微波等)將大分子糖鏈斷裂而獲取。此外，化學(xué)合成法可以合成寡糖，由于涉及糖苷化試劑選擇、中間產(chǎn)物合成、基團(tuán)保護(hù)、去除副產(chǎn)物等多步合成策略，僅適于實(shí)驗(yàn)室小量g級(jí)產(chǎn)品，難以大量制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種類蟲草活性寡糖的制備方法與應(yīng)用，該方法克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，具有合成速度快，無(wú)廢液、副反應(yīng)少，環(huán)保、產(chǎn)率高的特點(diǎn)。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種類蟲草活性寡糖的制備方法，制備步驟如下:
(1)配料:按照質(zhì)量配比:原料糖80%-90%，酸催化劑0.5%-4%，引發(fā)劑水6%~16%混合均勻；
(2)縮合反應(yīng):混合好的物料經(jīng)加熱融化，傳送置入凹槽帶式微波反應(yīng)器中，縮合反應(yīng)溫度控制在105~190°C，反應(yīng)時(shí)間3~10min，生成蟲草寡糖；
(3)純化:蟲草寡糖用乙醇低溫浸洗，去除單糖、二糖、糠醛及酸；所用乙醇質(zhì)量濃度為50%-80% ；
(4)濃縮:用乙醇浸洗后蟲草寡糖產(chǎn)物，真空濃縮至質(zhì)量濃度60%-80%;
(5)干燥:再真空干燥后粉粹，得到乳白色至微黃色、粉末狀類蟲草活性寡糖粉。
[0013]所述步驟(I)中原料糖為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖單體按照葡萄糖:半乳糖:甘露糖:鼠李糖質(zhì)量比1~10: 2-10: 1-20: 0.2~2不同比例混合物。
[0014]所述步驟(I)中酸催化劑為磷酸，鹽酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸之一種或幾種混合。
[0015]所述步驟(2)中縮合反應(yīng)產(chǎn)物蟲草寡糖為半流體，冷卻后形成固態(tài)。
[0016]所述步驟(2)中融化溫度80_120°C;凹槽帶式微波反應(yīng)器微波頻率2.45MHz，輸出功率 900~4000W。
[0017]所述步驟(2)中縮合反應(yīng)聚合物蟲草寡糖得率85%~90%。
[0018]所述步驟(4)中真空濃縮條件為真空度>10kPa，溫度30-60°C。
[0019]得到的蟲草寡糖為乳白至微黃色，平均分子量700-4000，聚合度4_22之間，其中蟲草寡糖含量大于95%，pH6.0-7.5，不含5-羥甲基糠醛。
[0020]用所述方法制備的類蟲草活性寡糖的應(yīng)用，制備的類蟲草活性寡糖具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、促進(jìn)乳桿菌、雙歧桿菌增殖，增強(qiáng)免疫力功效，并能降低肥胖動(dòng)物血脂、調(diào)整氧化還原狀態(tài)的作用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:本方法針對(duì)單糖不同位置羥基鍵能的差別，以及在反應(yīng)特定條件下羥基鏈接反應(yīng)難易不同的特點(diǎn)，由酸催化糖的復(fù)合反應(yīng)，由單糖合成寡糖及其混合物，經(jīng)乙醇沉淀去除單糖，干燥粉碎獲得產(chǎn)物，其單糖符合蟲草多糖的糖組成比例，鍵型以1-3，1-6，1-2為主。該方法具有合成速度快、無(wú)廢液、副反應(yīng)少、環(huán)保、產(chǎn)率高的特點(diǎn)。
[0022]本方法采用由特定的單糖按照一定比例，在電磁場(chǎng)作用下，合成類蟲草活性寡糖，分子量達(dá)到0.7-4kDa，聚合度4~22。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，其具有較好的體外抗氧化特性，并能促進(jìn)益生菌增殖；口服后，可降低肥胖小鼠的血脂、調(diào)整腸道菌群，增強(qiáng)免疫力，具有一定的減肥功效。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1本發(fā)明的類蟲草活性寡糖陰離子交換色譜(HPAEC)圖。A:標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效陰離子交換色譜圖，B:類蟲草多糖巨寡糖三氟乙酸水解產(chǎn)物的高效陰離子交換色譜圖。
[0024]圖2本發(fā)明的類蟲草活性寡糖氣相色譜(GC)圖。a:標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖，b:類蟲草多糖巨寡糖三氟乙酸水解產(chǎn)物的氣相色譜圖。
[0025]圖3本發(fā)明的類蟲草活性寡糖高效凝膠滲透色譜圖