一種檢測(cè)混合肉制品中牛肉成分質(zhì)量百分比的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)混合肉制品中牛肉成 分質(zhì)量百分比的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品的質(zhì)量和安全一直是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著人們生活水平的提高，肉制品消 費(fèi)已成為食品消費(fèi)的主流，要確保廣大消費(fèi)者的切身利益，就要保證各種肉制品質(zhì)量可靠。 目前利用肉制品摻雜摻假欺騙消費(fèi)者而牟取暴利的事件屢屢出現(xiàn)，而且如果清真食品中摻 有豬肉成分會(huì)涉及到宗教、民族問(wèn)題，不利于社會(huì)和諧穩(wěn)定。肉制品的"摻雜使假"不僅嚴(yán) 重?cái)_亂市場(chǎng)正常的競(jìng)爭(zhēng)次序，而且給消費(fèi)者的身心健康帶來(lái)許多負(fù)面影響，是一個(gè)世界性 的食品安全問(wèn)題。因此快速準(zhǔn)確科學(xué)檢測(cè)混合肉制品中特定肉源成分的質(zhì)量百分比，對(duì)食 品安全具有重要意義。
[0003]目前，肉種的鑒定技術(shù)以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或DNA序列特異性這兩種主要方法。以蛋白 質(zhì)為基礎(chǔ)的鑒定技術(shù)有一定的局限性，尤其當(dāng)肉類經(jīng)過(guò)加工過(guò)程，改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從 而破壞了物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定部位。DNA序列方面，特別是實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的出 現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且它采用了完全閉管檢測(cè)，避免了交叉污染，可實(shí) 行自動(dòng)化操作且耗時(shí)短，已成為分子生物學(xué)研究中的重要工具，亦被應(yīng)用于食品監(jiān)測(cè)中，是 現(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中指定的方法之一。該技術(shù)在一定意義上可對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，從而實(shí) 現(xiàn)定量檢測(cè)。當(dāng)前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在食品相關(guān)檢測(cè)研究中主要還是運(yùn)用在轉(zhuǎn)基因成分的 定量，食品成分方面的應(yīng)用局限于少數(shù)產(chǎn)品中，牛肉的定量檢測(cè)方面目前在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較 少。現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要是對(duì)食品中牛源性成分的定性檢測(cè)，但是目前無(wú)針對(duì)肉制品中牛肉 成分含量（w/w)的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，使得監(jiān)管部門很難判定違法廠商的責(zé)任。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種快速測(cè)定混合肉制品 中牛肉成分質(zhì)量百分比的試劑盒，所述試劑盒可以簡(jiǎn)便、快速、安全、特異性地定量檢測(cè)出 混合肉制品中牛肉成分的質(zhì)量百分比。本發(fā)明還提供用該檢測(cè)試劑盒檢測(cè)混合肉中牛肉質(zhì) 量百分比的方法，對(duì)食品安全檢測(cè)具有重要意義。
[0005]本發(fā)明的主要原理：以系列牛肉質(zhì)量百分比的混合肉樣基因組DNA模板作為標(biāo)準(zhǔn) 品。通過(guò)熒光PCR儀擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)樣品中真核生物通用基因和牛特異性基因的熒光強(qiáng)度后，制 成牛肉質(zhì)量百分比與ACt的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終在檢測(cè)時(shí)將提取的待測(cè)樣品DNA分別置于真 核生物通用檢測(cè)體系和牛特異性檢測(cè)體系中，經(jīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度得到ACt并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線 實(shí)現(xiàn)牛肉成分質(zhì)量百分比的定量檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)混合肉制品中牛肉成分質(zhì)量百分比的熒 光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包括：總DNA提取試劑，DNA純化試劑，18S熒 光定量PCR預(yù)混液試劑，Beef熒光定量PCR預(yù)混液試劑，標(biāo)準(zhǔn)品；所述的18S熒光定 量PCR預(yù)混液試劑是真核生物通用基因檢測(cè)的擴(kuò)增反應(yīng)液，其包括真核生物通用寡核 苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，具體為： 5' -CTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'，下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示，具體為： 5' -TAATTTGCGCGCCTGCTG-3' ；所述的Beef熒光定量PCR預(yù)混液試劑是牛特異性基因檢測(cè) 的擴(kuò)增反應(yīng)液，其包括牛特異性寡核苷酸的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列 如SEQIDNO: 3所示，具體為：5' -GGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3'，下游引物的核苷酸序列 物如SEQIDN0:4 所示，具體為：5' -GGATTGCTGATAAGAGGITGGTG-3'。
[0008] 所述真核生物的通用寡核苷酸引物是根據(jù)真核生物核糖體小亞基18SrRNA基因 序列的保守序列設(shè)計(jì)的。所述牛特異性寡核苷酸引物是根據(jù)不同動(dòng)物物種之間線粒體細(xì)胞 色素b基因上的DNA序列多態(tài)性設(shè)計(jì)的。所述真核生物的通用寡核苷酸引物和牛特異性寡 核苷酸引物的組合使用是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵，本發(fā)明的兩組引物對(duì)具有相似屬性，包括 引物Tm值、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度等，從而最大限度地降低了測(cè)試過(guò)程中的系統(tǒng)誤差。
[0009] 優(yōu)選地，所述總DNA提取試劑包括TNE裂解液、鹽酸胍溶液和蛋白酶K溶液；所 述TNE裂解液組成成分及終濃度為：10mmol/LTris，150mmol/LNaCl，2mmol/LEDTA， lg/100mLSDS;所述鹽酸胍溶液的終濃度為5mol/L的；所述蛋白酶K溶液的終濃度為 20mg/mL〇
[0010] 優(yōu)選地，所述DNA純化試劑購(gòu)于Promega公司的Wizar膽>DNAClean-UpSystem;
[0011] 優(yōu)選地，所述18S焚光定量PCR預(yù)混液試劑每個(gè)檢測(cè)單位由10IiL2xQuantiFast SYBRGreenPCRMasterMix，0.4yL上游引物，0.4yL下游引物，5.2yLCldH2O組成；所述 上游引物和下游引物的濃度均為10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBRGreenPCRMaster Mix購(gòu)于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit〇
[0012] 優(yōu)選地，所述Beef熒光定量PCR預(yù)混液試劑每個(gè)檢測(cè)單位由10yL2x QuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix，0. 4yL上游引物，0.4yL下游引物，5. 2yL ddH20組成；所述上游引物和下游引物的濃度均為10ymol/L;所述2xQuantiFastSYBR GreenPCRMasterMix購(gòu)于QIAGEN公司的QuantiFastSYBRkGreenPCRKit0
[0013] 優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品由系列牛肉質(zhì)量百分比的混合肉樣基因組DNA模板組成； 所述系列牛肉質(zhì)量百分比的混合肉樣分別為牛肉質(zhì)量百分比〇. 05%，0. 1 %，0. 5%，1 %， 2. 5%，5%，20%，45%，100% 的混合肉樣。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有陽(yáng)性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為純牛肉基因組DNA。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有陰性對(duì)照。所述陰性對(duì)照為非牛肉基因組DNA。
[0016] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有空白對(duì)照。所述空白對(duì)照不含DNA模板，可以CldH2O 代替。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還含有使用說(shuō)明書(shū)，便于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本發(fā)明的試 劑盒。
[0018] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的第二方面，還提供了一種采用前述試劑盒檢測(cè)混合肉制品中 牛肉成分質(zhì)量百分比的方法，包括下述步驟：
[0019] 1)待測(cè)樣品前處理：稱取2g待測(cè)樣品至50mL離心管，加入20mLPBS緩沖液，研 磨儀研磨80s，每組樣品設(shè)有6個(gè)平行樣。所述的PBS緩沖液購(gòu)于上海生工生物工程有限公 司，或由磷酸二氫鉀（KH2PO4)、磷酸氫二鈉（Na2HPO4)、氯化鈉（NaCl)、氯化鉀（KCl)自配成 PBS緩沖液；
[0020] 2)DNA提取和純化：取IOOmg樣品勻漿液與2.OmL離心管中，加入860 yL的TNE 裂解液、100 yL的鹽酸胍溶液，40 yL的蛋白酶K溶液，充分混勻；60°C溫浴4h;冷卻至室 溫，16700g離心15min，取500 yL的DNA上清液加入到2mL離心管中；加入ImL的WizarcT DNAClean-UpResin混合徹底，移至連接有'Wizard?'Minicolumn的5mL注射管中；按壓注 射器的內(nèi)芯，將混合物洗脫在Wizard8'Minicolumn并棄濾液；取下Wizard81Minicolumn后 拔出注射器內(nèi)芯并重新連接到注射管，添加2mL的80%異丙醇，按壓注射器內(nèi)芯洗滌棄濾 液；將Wizard'8'Minicolumn轉(zhuǎn)移到I. 5mL離心管，1000 Og離心 2min，靜置 5min;將Wizard* Minicolumn移至新的I. 5mL離心管上，加入50yLpH8. 0的TE緩沖液靜置lmin，1000 Og 離心30s洗脫得到純化的DNA模板；提取的DNA質(zhì)量用核酸蛋白分析儀進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)OD26q/ OD28。比值在1. 7~2. 0之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增，將DNA稀釋至5ng/yL;所述的TNE裂解 液、鹽酸胍溶液、蛋白酶K溶液包括在所述檢測(cè)混合肉制品中牛肉成分質(zhì)量百分比的熒光 定量PCR檢測(cè)試劑盒的總DNA提取試劑中；所述的WizarcfDNAClean-UpResin和Wizarcf Minicolumn包括在所述檢測(cè)混合肉制品中牛肉成分質(zhì)量百分比的熒光定量PCR檢測(cè)試劑 盒中的DNA純化試劑中；所述的異丙醇溶