一種檢測肼的近紅外比率熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種近紅外熒光探針，尤其涉及一種用于檢測肼的近紅外熒光探針及 其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 香豆素母環(huán)為苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，本身具有較大的摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，有多 個位點(diǎn)可以修飾，并且能夠達(dá)到近紅外發(fā)光，可用于發(fā)光材料、化學(xué)傳感器以及標(biāo)記生物分 子等。近幾年利用比率熒光效應(yīng)檢測小分子肼的研究得到不斷發(fā)展。
[0003] 肼是一種非常重要的活性堿和強(qiáng)還原劑，在化學(xué)領(lǐng)域可以用作催化劑、乳化劑、醫(yī) 藥中間體、紡織染料、攝影化學(xué)品等。同時肼作為一種高能燃料推進(jìn)劑在導(dǎo)彈、衛(wèi)星和火箭 推進(jìn)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。但是，肼也是美國環(huán)保署規(guī)定的一種毒性物質(zhì)，通過呼吸和皮 膚接觸進(jìn)入人體，對人體的肝、腎、肺及神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害。因此限定其在飲用水中的含量 不可超過lOppb。鑒于肼的以上性質(zhì)，在生物體中方便快捷檢測肼尤為重要。
[0004] 目前檢測肼的常用方法有電化學(xué)法和化學(xué)發(fā)光法，其中熒光光譜分析法有著 操作簡單、靈敏度高、選擇性好、生物相容性好等優(yōu)勢。已申請的專利【CN10392307IA】、 【CN104109126A】展示了特異性選擇肼的熒光探針，但是都存在著波長短、無法檢測氣態(tài)肼、 無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像等缺點(diǎn)。鑒于此，開發(fā)近紅外發(fā)光，具有細(xì)胞成像能力，而且可以比率檢 測、裸眼識別的肼的熒光探針成為目前亟待解決的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種檢測肼的近紅比率熒光探 針及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的近紅外比率熒光探針，其特征在于：所述熒光探針是含雙香豆素結(jié) 構(gòu)的4-(2' -甲羧基苯基）_2_(7' -二乙胺基香顯素）_7_二乙胺基苯并吡喃尚氯酸鹽，其 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I)所示，
[0007]
[0008] 上述的近紅外比率熒光探針的制備方法是：由已知方法合成的2-(2-羥基-4-二 乙胺基苯甲酰基）苯甲酸和3-乙?；?7二乙胺基香豆素在濃硫酸中控溫反應(yīng)，反應(yīng)液冷 卻、加高氯酸氧化得到目標(biāo)熒光探針。
[0009] 上述的近紅外比率熒光探針在檢測含肼的樣品中的應(yīng)用。
[0010] 上述應(yīng)用中：所述含肼的樣品優(yōu)選是生物細(xì)胞、血清、含肼的溶液或者氣態(tài)肼。
[0011] 本發(fā)明所述的近紅外比率熒光探針在制備裸眼檢測肼的硅膠板中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明所述的探針4-(2' -甲羧基苯基）-2-(7' -二乙胺基香豆素）-7-二乙胺基 苯并吡喃高氯酸鹽的羧基在水溶液可以先與肼生成酰肼，再形成螺環(huán)，由大共輒體系的紅 光變成香豆素的藍(lán)色熒光，從而達(dá)到比率檢測的效果。反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)譜如圖1。
[0013] 具體的：配制4_(2' -甲羧基苯基）-2_(7' -二乙胺基香豆素）-7_二乙胺基苯并 吡喃高氯酸鹽的PBS緩沖液（DMS0:PBS = 2:3, v:v，pH = 7. 4)的溶液，分別定量加入微升 級的 N2H4, CH3CO2，Br，H2PO4，HCO 32，HPO42，HSO3，I，NO 2，NO3，SO32，SO4 2，Ca2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+，Na2S, Zn2+的水溶液。通過紫外可見分光光度法和熒光分光光度法測試其對常見陰離 子、陽離子的選擇性和響應(yīng)能力。結(jié)果顯示該探針對肼有很好的選擇性，加入痕量肼前后對 照顯示紫外吸收和熒光發(fā)射波長分別發(fā)生了 167和201nm的藍(lán)移，具有非常好的比率響應(yīng)。 見圖2,3,4。
[0014] 在100%胎牛血清中加入5 μΜ的該探針孵育和不同濃度的N2H4共同孵育2h。純 血清在兩個通道基本無熒光，探針在藍(lán)色通道顯弱光，紅色通道發(fā)強(qiáng)熒光，隨著N2H4濃度的 增加，藍(lán)色熒光逐漸加強(qiáng)，紅色熒光逐漸減弱。見圖5。
[0015] 在加入5. 0 μ M的該探針的HeLa活細(xì)胞中不加入N2H4和加入不同濃度的N2H 4對照 細(xì)胞染色熒光顯微成像變化。熒光成像顯示該探針滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。對照組細(xì)胞藍(lán)色通道有 微弱熒光，紅色通道亮色熒光。加入不同濃度的N2H4時，對照組細(xì)胞藍(lán)色通道顯亮熒光，紅 色通道熒光淬滅。見圖6。
[0016] 將0. lmg/mL的該探針的硅膠板放置于盛有不同胺和不同濃度肼的容量瓶的瓶 口，IOmin后置于紫外燈下拍照。（a)組是不同的胺類化合物（從左向右以此為：空白、氨 水、甲胺、硫脲、乙二胺、過氧化氫、尿素、肼），結(jié)果顯示只有肼能使硅膠板變色；(b)組是不 同濃度的肼，紫外燈下顯示硅膠板隨肼濃度增大，由紅色變成藍(lán)色，見圖7。
[0017] 本發(fā)明提供的近紅外比率熒光探針可以選擇性地與N2H4作用，由綠色變?yōu)辄S色， 可肉眼分辨，熒光由紅色變?yōu)樗{(lán)綠色，具有非常好的熒光比率響應(yīng)效應(yīng)，也可以通過紫外吸 收和熒光光度法進(jìn)行分析。不僅可以比率檢測N2H4，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的比率成像，而且做成的硅 膠板可以迅速裸眼檢測氣態(tài)N2H4的含量。有望在工業(yè)生產(chǎn)和生物科學(xué)中發(fā)揮作用，具有廣 闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為探針與N2H4加成產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜。
[0019] 圖2為探針的PBS緩沖液（DM0S:PBS = 2:3, V:v，pH = 7. 4)中加入和不加入N2H4時的紫外吸收圖譜。
[0020] 圖3為探針的PBS緩沖液（DM0S:PBS = 2:3, V: V，pH = 7. 4)中加入和不加入N2H4時的熒光發(fā)射圖譜。
[0021] 圖4為探針的PBS緩沖液（DM0S:PBS = 2:3, V:V，pH = 7. 4)中加入多種陰離子和 陽離子的熒光發(fā)射圖譜。
[0022] 圖5為探針在胎牛血清中的熒光成像。37°C條件下，在含有不同濃度肼 (0, 10, 50, 100, 500, 1000 μΜ)的牛血清溶液中加入5. 0 μΜ的探針培養(yǎng)2h的熒光強(qiáng)度。
[0023] 圖6為探針在HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。
[0024] 其中：在37°C條件下，HeLa細(xì)胞在加入5. 0 μΜ的探針的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小 時；PBS緩沖溶液洗滌三次后，再加入不同濃度的N2H4 (0, 10, 50, 100, 500, 1000 μ Μ)培養(yǎng)2 小時的圖像。
[0025] 圖7為探針作為檢測氣態(tài)肼的硅膠板在紫外燈下獲得的照片。
[0026] 其中：用0. lmg/mL的探針溶液浸泡硅膠板，烘干制成條狀，然后放置于盛有不同 胺和不同濃度肼的容量瓶的瓶口，IOmin后置于紫外燈下拍照。（a)組是不同的胺類化合物 (從左向右以此為：空白、氨水、甲胺、硫脲、乙二胺、過氧