嗜血桿菌菌種保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及臨床微生物檢驗(yàn)苛養(yǎng)菌菌種保存領(lǐng)域，尤其涉及一種嗜血桿菌菌種保 存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，嗜血桿菌保存方法主要有甘油血清肉湯法、脫脂牛乳法、紙片法、真空冷凍 干燥法，用真空冷凍干燥法保存嗜血桿菌效果雖佳，但此法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且需要 價(jià)格昂貴的冷凍真空干燥箱和真空栗等設(shè)備，給實(shí)際工作帶來不便，而其余三種方法操作 雖然簡單，但嗜血桿菌存活期限1-6個(gè)月不等，而且未見生化性狀及藥敏特征是否改變的 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種嗜血桿菌保存方法，解決目前 嗜血桿菌保存操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，滿足嗜血桿菌菌種保 存的需求。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案：這種嗜血桿菌菌種保存方法，包括如下 步驟：
[0005] 第一步，嗜血桿菌保存液制作，選取100mL甘油和100mL蒸餾水混合均勻制作成 初級培養(yǎng)基，然后將初級培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時(shí)間為 15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出初級培養(yǎng)基，此時(shí)，初級培養(yǎng)基的溫度為 92°C~98°C，然后在初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，獲得嗜血桿菌保存 液，待嗜血桿菌保存液冷卻至室溫后，分裝到IOml無菌試管中，每支試管裝5ml嗜血桿菌保 存液；
[0006] 第二步，嗜血桿菌菌種保存，先取500ml哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行 滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出哥 倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，此時(shí)，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基的溫度為92°C~98°C，然后在哥倫比亞瓊 脂培養(yǎng)基中緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，待冷卻至50°C時(shí)加入濃度為100mg/ml的萬古 霉素0. 25ml，配制成萬古霉素濃度為50mg/L的巧克力平板培養(yǎng)基，然后取嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌 株接入巧克力平板培養(yǎng)基，接著在C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)，獲得嗜血桿菌菌種，接 著取IOml無菌試管的嗜血桿菌保存液，然后將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存液中，再 分裝到0. 5ml的無菌試管中，接著立即置入到-38°C以下的冰箱中進(jìn)行保存；
[0007] 第三步，取用，取用時(shí)，將0. 5ml的試管從冰箱中取出，然后置于35°C的培養(yǎng)箱中 復(fù)溶5min，然后立即轉(zhuǎn)移到巧克力平板培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)。
[0008] 進(jìn)一步的，第一步、第二步中的滅菌器采用濕熱滅菌器。
[0009] 嗜血桿菌氧化還原酶系統(tǒng)不完善，對培養(yǎng)條件的要求較高，因此，其分離培養(yǎng)較為 困難，生長時(shí)需要X因子和V因子兩種輔助生長因子，破壞紅細(xì)胞能夠使X因子和V因子從 紅細(xì)胞中釋放，用以培養(yǎng)嗜血桿菌，X因子指的是正鐵血紅素，V因子指的是煙酰胺腺嘌呤 二核苷酸。
[0010] 本發(fā)明的嗜血桿菌菌種保存方法，原料的配比上，甘油與蒸餾水的比例為1:1，因 此，制備出來的初級培養(yǎng)基中含有50%的甘油，甘油在這個(gè)配比下，嗜血桿菌在-38°C以下 溫度保存時(shí)能夠避免水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞，起到保護(hù)嗜血桿菌菌種的作用，甘油量小 于50%會造成保護(hù)作用不足，水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞，甘油量大于50%又會造成蒸餾水 不足，無法滿足嗜血桿菌的培養(yǎng)需求，因此，在這個(gè)配比作用下，嗜血桿菌菌種能夠延長存 活時(shí)間，延長了嗜血桿菌的保存期限，在本發(fā)明的嗜血桿菌菌種保存方法中，第一步制作 出嗜血桿菌保存液，在制作嗜血桿菌保存液的過程中，先將甘油和蒸餾水混合制作成初級 培養(yǎng)基，然后對初級培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，在121°C的溫度下殺滅其他雜菌，保證嗜血桿菌菌種 的唯一性，當(dāng)滅菌結(jié)束滅菌器壓力表的壓力降到零后，此時(shí)，初級培養(yǎng)基的溫度為92°C~ 98°C，在這個(gè)溫度下向初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，初級培養(yǎng)基將羊 血中水解V因子的酶類破壞，從而保留了紅細(xì)胞釋放的V因子活性，無需再添加額外的V因 子，在這個(gè)溫度下初級培養(yǎng)基能夠完全破壞羊血中水解V因子的酶類，而低于92°C不能夠 完全破壞羊血中水解V因子的酶類，需要額外添加 V因子，增加了成本，增加了操作步驟， 操作繁瑣麻煩，而高于98°C會破壞V因子的活性，因此，這個(gè)溫度下能夠完全破壞羊血中水 解V因子的酶類，無需再添加 V因子，降低了成本，減少了操作步驟，操作簡單方便，加入無 菌脫纖維羊血后獲得嗜血桿菌保存液，在第二步中，將嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接入到巧克力平 板培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，巧克力平板培養(yǎng)基制作過程中也將羊血中水解V因子的酶類破壞， 從而保留了紅細(xì)胞釋放的V因子活性，無需再添加額外的V因子，經(jīng)過培養(yǎng)獲得嗜血桿菌菌 種，然后再將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存液中進(jìn)行保存，接著置入到_35°C的溫度下 進(jìn)行保存，通過這兩個(gè)步驟保存的嗜血桿菌菌種，生長良好，生化性狀穩(wěn)定，藥敏特性符合 CLSI的要求，保存時(shí)間長，操作簡便，成本低，省時(shí)省力，解決目前嗜血桿菌保存操作繁瑣、 費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，滿足嗜血桿菌菌種保存的需求，在第三步中， 取出時(shí)先復(fù)溶，再置于轉(zhuǎn)移到巧克力培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)也是保 存方法的一步，保持嗜血桿菌菌種取出過程中保持活性，保存效果好。
[0011] 本發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明的嗜血桿菌菌種保存方法，保存的嗜血桿菌菌種生 長良好，生化性狀穩(wěn)定，藥敏特性符合CLSI的要求，保存時(shí)間長，操作簡便，成本低，省時(shí)省 力，解決目前嗜血桿菌保存操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，保存效 果好，滿足嗜血桿菌菌種保存的需求，利于推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0013] 實(shí)施例一：
[0014] 這種嗜血桿菌菌種保存方法，包括如下步驟：
[0015] 第一步，嗜血桿菌保存液制作，選取100mL甘油和100mL蒸餾水混合均勻制作成 初級培養(yǎng)基，然后將初級培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時(shí)間為 15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出初級培養(yǎng)基，此時(shí)，初級培養(yǎng)基的溫度為 92°C，然后在初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，獲得嗜血桿菌保存液，待嗜 血桿菌保存液冷卻至室溫后，分裝到IOml無菌試管中，每支試管裝5ml嗜血桿菌保存液；
[0016] 第二步，嗜血桿菌菌種保存，先取500ml哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行 滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，此時(shí)，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基的溫度為92°C，然后在哥倫比亞瓊脂培 養(yǎng)基中緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，待冷卻至50°C時(shí)加入濃度為100mg/ml的萬古霉 素0. 25ml，配制成萬古霉素濃度為50mg/L的巧克力平板培養(yǎng)基，然后取嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC49247接入巧克力平板培養(yǎng)基，接著在C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)，獲得嗜血桿菌 菌種，接著取IOml無菌試管的嗜血桿菌保存液，然后將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存 液中，再分裝到0. 5ml的無菌試管中，接著立即置入到-38°C以下的冰箱中進(jìn)行保存；
[0017] 第三步，取用，取用時(shí)，將0.5ml的試管從冰箱中取出，然后置于35°C的培養(yǎng)箱中 復(fù)溶5min，然后立