即轉(zhuǎn)移到巧克力平板培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)。
[0018] 進(jìn)一步的，第一步、第二步中的滅菌器采用濕熱滅菌器。
[0019] 實(shí)施例二：
[0020] 這種嗜血桿菌菌種保存方法，包括如下步驟：
[0021] 第一步，嗜血桿菌保存液制作，選取100mL甘油和100mL蒸餾水混合均勻制作成 初級培養(yǎng)基，然后將初級培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為 15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出初級培養(yǎng)基，此時，初級培養(yǎng)基的溫度為 95°C，然后在初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，獲得嗜血桿菌保存液，待嗜 血桿菌保存液冷卻至室溫后，分裝到IOml無菌試管中，每支試管裝5ml嗜血桿菌保存液；
[0022] 第二步，嗜血桿菌菌種保存，先取500ml哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行 滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，此時，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基的溫度為95°C，然后在哥倫比亞瓊脂培 養(yǎng)基中緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，待冷卻至50°C時加入濃度為100mg/ml的萬古霉 素0. 25ml，配制成萬古霉素濃度為50mg/L的巧克力平板培養(yǎng)基，然后取嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC49247接入巧克力平板培養(yǎng)基，接著在C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)，獲得嗜血桿菌 菌種，接著取IOml無菌試管的嗜血桿菌保存液，然后將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存 液中，再分裝到0. 5ml的無菌試管中，接著立即置入到-38°C以下的冰箱中進(jìn)行保存；
[0023] 第三步，取用，取用時，將0. 5ml的試管從冰箱中取出，然后置于35°C的培養(yǎng)箱中 復(fù)溶5min，然后立即轉(zhuǎn)移到巧克力平板培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)。
[0024] 進(jìn)一步的，第一步、第二步中的滅菌器采用濕熱滅菌器。
[0025] 實(shí)施例三：
[0026] 這種嗜血桿菌菌種保存方法，包括如下步驟：
[0027] 第一步，嗜血桿菌保存液制作，選取100mL甘油和100mL蒸餾水混合均勻制作成 初級培養(yǎng)基，然后將初級培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為 15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出初級培養(yǎng)基，此時，初級培養(yǎng)基的溫度為 98°C，然后在初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，獲得嗜血桿菌保存液，待嗜 血桿菌保存液冷卻至室溫后，分裝到IOml無菌試管中，每支試管裝5ml嗜血桿菌保存液；
[0028] 第二步，嗜血桿菌菌種保存，先取500ml哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行 滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，此時，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基的溫度為98°C，然后在哥倫比亞瓊脂培 養(yǎng)基中緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，待冷卻至50°C時加入濃度為100mg/ml的萬古霉 素0. 25ml，配制成萬古霉素濃度為50mg/L的巧克力平板培養(yǎng)基，然后取嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC49247接入巧克力平板培養(yǎng)基，接著在C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)，獲得嗜血桿菌 菌種，接著取IOml無菌試管的嗜血桿菌保存液，然后將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存 液中，再分裝到0. 5ml的無菌試管中，接著立即置入到-38°C以下的冰箱中進(jìn)行保存；
[0029] 第三步，取用，取用時，將0. 5ml的試管從冰箱中取出，然后置于35°C的培養(yǎng)箱中 復(fù)溶5min，然后立即轉(zhuǎn)移到巧克力平板培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)。
[0030] 進(jìn)一步的，第一步、第二步中的滅菌器采用濕熱滅菌器。
[0031] 選取100份本發(fā)明實(shí)施例一、實(shí)施例二、實(shí)施例三保存的嗜血桿菌菌種與甘油血 清肉湯法、脫脂牛乳法、紙片法、真空冷凍干燥法保存的嗜血桿菌菌種進(jìn)行對比，對比結(jié)果 如下：
[0033] 從上表可知，本發(fā)明實(shí)施例保存的嗜血桿菌菌種，在生長狀況、操作過程難易程 度、保存期限上均優(yōu)于其他方法保存的嗜血桿菌，能夠?qū)嶋H解決目前嗜血桿菌保存操作繁 瑣、費(fèi)時費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，滿足嗜血桿菌菌種保存的需求。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例的特點(diǎn)是：本發(fā)明的嗜血桿菌菌種保存方法，保存的嗜血桿菌菌種 生長良好，生化性狀穩(wěn)定，藥敏特性符合CLSI的要求，保存時間長，操作簡便，成本低，省時 省力，解決目前嗜血桿菌保存操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，保存 效果好，滿足嗜血桿菌菌種保存的需求，利于推廣。
[0035] 雖然本發(fā)明已通過參考優(yōu)選的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是，本專業(yè)普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)了解，在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可作形式和細(xì)節(jié)上的各種各樣變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嗜血桿菌菌種保存方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 嗜血桿菌保存液制作，選取100mL甘油和100mL蒸餾水混合均勻制作成初級培養(yǎng) 基，然后將初級培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅菌溫度為121°C，滅菌時間為15min，待 滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出初級培養(yǎng)基，此時，初級培養(yǎng)基的溫度為92°C~ 98°C，然后在初級培養(yǎng)基中持續(xù)緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，獲得嗜血桿菌保存液，待嗜 血桿菌保存液冷卻至室溫后，分裝到IOml無菌試管中，每支試管裝5ml嗜血桿菌保存液； (2) 嗜血桿菌菌種保存，先取500ml哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基置入滅菌器中進(jìn)行滅菌，滅 菌溫度為121°C，滅菌時間為15min，待滅菌器壓力表的壓力降到零后，立即取出哥倫比亞 瓊脂培養(yǎng)基，此時，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基的溫度為92°C~98°C，然后在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng) 基中緩慢加入無菌脫纖維羊血25ml，待冷卻至50°C時加入濃度為lOOmg/ml的萬古霉素 0. 25ml，配制成萬古霉素濃度為50mg/L的巧克力平板培養(yǎng)基，然后取嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接 入巧克力平板培養(yǎng)基，接著在C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)，獲得嗜血桿菌菌種，接著取 IOml無菌試管的嗜血桿菌保存液，然后將嗜血桿菌菌種接入到嗜血桿菌保存液中，再分裝 到0. 5ml的無菌試管中，接著立即置入到-38°C以下的冰箱中進(jìn)行保存； (3) 取用，取用時，將0. 5ml的試管從冰箱中取出，然后置于35°C的培養(yǎng)箱中復(fù)溶5min， 然后立即轉(zhuǎn)移到巧克力平板培養(yǎng)基上，置于C02環(huán)境、35°C溫度中過夜培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜血桿菌菌種保存方法，其特征在于：所述步驟（1)、步驟 (2)中的滅菌器采用濕熱滅菌器。
【專利摘要】一種嗜血桿菌菌種保存方法，通過嗜血桿菌保存液制作、嗜血桿菌菌種保存、取用的步驟來保存嗜血桿菌菌種。本發(fā)明有益的效果是：采用本發(fā)明保存的嗜血桿菌菌種生長良好，生化性狀穩(wěn)定，藥敏特性符合CLSI的要求，保存時間長，操作簡便，成本低，省時省力，解決目前嗜血桿菌保存操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力，并且嗜血桿菌存活期限短的問題，保存效果好，滿足嗜血桿菌菌種保存的需求，利于推廣。
【IPC分類】C12R1/21, C12N1/04
【公開號】CN105018347
【申請?zhí)枴緾N201510455744
【發(fā)明人】傅石明
【申請人】傅石明
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月29日