一種細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的制備方法及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的方法以及通過所述方法獲得細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，特別地，本發(fā)明涉及構建RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1的雙基因的重組慢病毒載體，使得人干細胞能過表達RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1 ;本發(fā)明的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞增殖活性和端粒酶活性提高，延長了人干細胞壽命，促進了新生血管形成，而無成瘤性，可望用于臨床治療缺血性心腦血管疾病，提高了受損部位血供，促使了受損神經細胞的修復。
【背景技術】
[0002]目前動物體內實驗和臨床研究工作，證實成體干細胞移植治療缺血性心腦血管疾病有治療效果，促進了缺血部位的新血管再生提高患者的功能狀態(tài)，改善患者的生活質量。成體干細胞應用細胞治療的主要優(yōu)勢在于其可以自體移植，因而不存在胚胎干細胞移植所存在的免疫排斥、倫理學及致瘤性等方面的限制，具有良好的臨床應用前景。但是成體干細胞在體內數(shù)量稀少，用于自體移植需要在體外大量擴增，才能滿足細胞治療的需要。
[0003]然而，成體干細胞同大多數(shù)的成體細胞一樣，會發(fā)生衰老，主要表現(xiàn)在兩個方面:①隨年齡增長，BMSCs的數(shù)量和質量均有明顯下降(而老年人正是缺血性心腦血管病的高發(fā)人群，是可能的需要細胞移植治療的主體)；②在體外擴增過程中，細胞的增殖能力、分化潛力、乃至向病灶區(qū)歸巢的能力均會逐漸喪失。這嚴重限制了成體干細胞自體移植的臨床應用。
[0004]本發(fā)明利用人于細胞修復和“歸巢”特性，將構建好的能過表達RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1，使得人干細胞能延長細胞壽命，增強成血管能力，而無成瘤性。人干細胞來源方便，主要包括人基質干細胞、內皮祖細胞、神經干細胞和胚胎干細胞等，細胞培養(yǎng)獲得簡單，可以做到個體化，也可以作為異體規(guī)模化生產。因而，本發(fā)明細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞制備簡單，促進缺血區(qū)的新血管再生，創(chuàng)造有利于神經再生的微環(huán)境，有望對缺血性心腦血管病較好的治療效果，能個體化臨床治療，也能作為規(guī)模化生產的產品應用于臨床治療缺血性心腦血管疾病。

【發(fā)明內容】

[0005]許多基礎研究及臨床研究已經證實，干細胞在治療缺血性心腦血管疾病中發(fā)揮著獨特的功能，能促進缺血區(qū)的新血管再生及神經再生，修復受損的組織，同時也能分泌神經營養(yǎng)因子和細胞因子，改善機體微環(huán)境。然而臨床使用的人干細胞均需要在體外大量擴增培養(yǎng)，保證足夠的數(shù)量進行臨床治療。人成體干細胞均有壽命，一旦體外擴增到幾代后就出現(xiàn)生長速率減緩，其端粒變短，分化潛能減弱、“歸巢”能力降低和成血管能力也大打折扣。
[0006]人干細胞衰老分子機制還不清楚，研究證實端粒酶活性降低使得端粒變短是一個非常重要的原因。RNA睪丸信號轉導與激活子(testis-signal transduct1n andactivator of RNA, T-STAR)參與酪氨酸蛋白激酶信號傳遞并通過介入端粒酶反轉錄酶的磷酸化促進端粒酶活化，從而催化TTAGGG重復序列增加到染色體末端，以維持端粒長度，也是保持細胞復制活性的關鍵因素。
[0007]血管生成素-1 (ang1poietin-1，Angl)在胚胎發(fā)育過程中血管生成和成年人血管再生的關鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)Angl在神經保護，以及局部腦出血后神經生長和血管生成中起到重要的作用。
[0008]本發(fā)明是我們長期科研工作，發(fā)現(xiàn)了 T-STAR和Angl雙慢病毒載體轉染的人干細胞，能提高端粒酶活性，保持端粒長度，而延長了干細胞的壽命；同時增強了成血管生成的能力，而且無成瘤活性。這一結果就提示了我們可以通過轉染T-STAR和Angl雙慢病毒載體轉染方法，提高人干細胞的體外增殖能力，經大量傳代培養(yǎng)后仍具有很強的增殖能力，并具有高活性的成血管生長能力。因而這樣保證了臨床治療使用的細胞數(shù)量的同時，也保持了干細胞很強的增殖、分化、歸巢以及成血管生成活性，可能在臨床治療缺血性心腦血管疾病中發(fā)揮著更好的作用。
[0009]本發(fā)明提供了一種細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的制備方法，其中，所述方法包括構建RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1的雙基因片段，重組到病毒載體上，轉染人干細胞制備成可延長細胞壽命的人干細胞，以促使人干細胞提高成血管活性，但無成瘤性。
[0010]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，通過PCR技術擴增RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1 cDNA序列，分別重組到表達質粒上，經酶切位點連接到病毒載體上，兩個基因重組病毒載體共轉染，包裝成病毒后轉染人干細胞，獲得細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞。
[0011]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，傳代培養(yǎng)到10代后倒置顯微鏡下觀察仍具有干細胞形態(tài)，培養(yǎng)到120天還具有很好增殖能力；而未轉染T-STAR和Angl雙慢病毒載體的干細胞倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)生變化，培養(yǎng)到120天細胞已無法繼續(xù)擴增。
[0012]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，相對端粒酶活性得到顯著提高，與未轉染T-STAR和Angl雙慢病毒載體的干細胞相比，具有顯著差異，是其的76.4倍以上。
[0013]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，體內成血管能力與未轉染T-STAR和Angl雙慢病毒載體的干細胞相比，具有明顯的差異，是其的3.1倍以上。
[0014]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，體內、體外成瘤實驗中未發(fā)現(xiàn)成瘤現(xiàn)象，保證了其安全性。
[0015]所述人干細胞包括人基質干細胞、人內皮祖細胞、人神經干細胞和人胚胎干細胞等，優(yōu)選地，為人基質干細胞和人內皮祖細胞。由于人干細胞來源方便，細胞培養(yǎng)獲得簡單，可以從患者骨髓個體化獲得，也可以作為異體規(guī)?；a，能做到個體化應用，也能作為規(guī)模化生產的產品。人神經干細胞來源人廢棄臍帶血、胎盤血或自體骨髓等，優(yōu)選地，來源于人自體骨髓。
[0016]本發(fā)明所述的病毒載體，可以在細胞內穩(wěn)定增殖和表達目的基因，主要為慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒等，優(yōu)選地，選擇慢病毒表達系統(tǒng)。
[0017]本發(fā)明還提供一種細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0018]I)人干細胞基礎培養(yǎng)基；
[0019]2)包裝好的T-STAR和Angl基因的慢病毒載體；
[0020]3)消化細胞的酶；
[0021]4)細胞因子以及；
[0022]5)使用說明書；
[0023]其中，所述使用說明書包括本發(fā)明中所述的方法。培養(yǎng)獲得人干細胞的來源為人廢棄臍帶血、胎盤血或自體骨髓等，優(yōu)選地，來源于人自體骨髓。
[0024]所述的過表達病毒載體包括病毒、腺病毒、逆轉錄病毒等，優(yōu)選地，選擇慢病毒表達系統(tǒng)。
[0025]本發(fā)明還提供所述細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的應用，保證了體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的人干細胞，
[0026]并具有促血管再生能力，能用于從人干細胞修復缺血性心腦血管疾病中損傷的血管細胞并促進神經細胞再生。
【附圖說明】
[0027]圖1表示為重組T-STAR和Angl在實施例1中制備的重組T-STAR和Angl雙慢病毒轉染hMSCs后基因表達水平
[0028]圖2表示為hMSCs細胞群體倍增水平曲線對比圖
[0029]圖3表示為hMSCs倒置顯微鏡下觀察的細胞形態(tài)比較圖
[0030]圖4表示為檢測hBMSC相對端粒酶活性的對比圖
[0031]圖5表示為hBMSCs裸鼠體內皮下注射后成血管能力對比結果圖
[0032]圖6表示為hBMSCs裸鼠體內皮下注射后成瘤結果圖
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明提供了一種細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞的制備方法，其中，所述方法包括構建RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1的基因片段，重組到病毒載體上，轉染人干細胞制備細胞壽命延長的人干細胞，3促使人干細胞提高成血管能力，且無成瘤性。
[0034]本發(fā)明所述的細胞壽命延長及成血管能力增強的人干細胞，通過PCR技術擴增得到RNA睪丸信號轉導與激活子和血管生成素-1 cDNA序列，分別基因重組到表達質粒上，例如PET系列、pUC系列和pDONR系列等表達質粒。
[0035]T-STAR和Angl基因重組后分別引入雙酶切位點，連接到病毒載體上，取對數(shù)生長期的293FT細胞，以(2?2.5) XlO6細胞數(shù)接種于1cm的細胞培養(yǎng)皿中，于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，細胞融合度為60%?80%時利用Lipofectamine?2000轉染進行T-STAR和Angl病毒包裝。48?72小時后收集病毒上清液，4°C、3000r/min離心5min后，用直徑為0.45 μ m的濾膜過濾分裝，用于細胞感染。轉染分為4組:未轉染對照組，T-STAR單基因轉染組，Angl單基因轉染組，T-STAR和Ang