硫柳汞在熒光定量pcr中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明針對生物化學領域，涉及硫柳汞在熒光定量PCR中的應用，特別是用于核 酸檢測熒光定量PCR。
【背景技術】
[0002] 定量PCR是在定性PCR基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術 (Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction, FQ-PCR)于 1996 年由美國Applied Biosystems推出，它是在PCR反應體系中加入熒光探針，通過熒光信 號的不斷積累來實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標準曲線來計算出待測樣品的起始拷 貝數(shù)。該技術不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，并且與普通PCR相比，它具有范圍寬 (0-1 X 10s)、靈敏度高(可檢測〈5個拷貝）、特異性強、精確度高（CV〈2%)、無需后續(xù)處理、避 免了交叉污染及可以進行多重檢測的優(yōu)點而被廣泛應用于科研及臨床診斷等領域。
[0003] PCR增強劑在PCR反應中起到提高反應的特異性、增加 PCR擴增靈敏度及防止無效 擴增等有益效果而被廣泛應用于PCR體系中。迄今為止，在提高PCR擴增能力、增強反應體 系穩(wěn)定性的研究中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的PCR增強劑和穩(wěn)定劑，它們都以各自的特 性在不同的方面對PCR反應起著促進作用。如甲酰胺是被較早發(fā)現(xiàn)并廣泛應用的PCR添加 劑之一，據(jù)報道，它能顯著提高PCR反應的特異性。Rapley等人于1994年研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌 體基因32編碼蛋白及大腸桿菌單鏈結合蛋白對數(shù)種模板的PCR反應均有提高效率的作用。 Rees WA等人通過研究發(fā)現(xiàn)在長片段PCR中添加甜菜堿能降低熱變性溫度和退火溫度，進 而能促進高GC含量片段的擴增，而且還能提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。Eric Chevet等人發(fā)現(xiàn)在 體系中添加氯化四甲基銨（TMC)可以提高AT含量豐富的DNA片段的Tm值，從而通過改善 引物的特異性結合來提高PCR反應的特異性。牛血清白蛋白（BSA)則能夠通過防止聚合酶 的變性提高擴增反應效率。DMSO是用于增強反應特異性的常見添加劑，加入DMSO有利于減 少DNA的二級結構，使高GC含量的模板的易于完全變性。
[0004] 隨著對PCR增強劑的研究深入，人們逐漸從研究和應用單一型PCR增強劑轉向研 究和應用復合型PCR增強劑。Musso等應用I. 3M甜菜堿，50uM7-deaza-dGTP及5% DMSO混 合而成的復合型增強劑高產(chǎn)量擴增了 GC含量為79%的長度為392bp的DNA片段，接下來在 另外兩段DNA片段（GC含量為67. 8%和72. 7% )的擴增中這種復合型PCR添加劑同樣能幫 助獲得高特異性的擴增產(chǎn)物。隨著熒光定量PCR應用的進一步擴大，傳統(tǒng)PCR增強劑已經(jīng) 不能滿足日新月異的PCR體系，近年來，科研人員已經(jīng)將目光轉向新材料、新化合物。比如 納米材料等。但是，多年來人們對這些添加劑的研究表明，它們在一定的濃度范圍內(nèi)對某些 PCR有著增效作用，但在另外一些情況下或在其它的濃度范圍內(nèi)對PCR反應又有著抑制作 用，所以PCR添加劑在不同反應體系中的應用應通過試驗來合理選擇，因此，優(yōu)化的PCR反 應體系配方或添加劑組合會使PCR反應獲得很大的改善。
[0005] 硫柳汞（LLG，又稱乙汞硫柳酸鈉）是一種有機汞化合物，長期以來，作為安全的防 腐劑一直被廣泛用于生物制品及藥物注射劑中（包括乙肝疫苗、百日咳疫苗、眼藥水、免疫 球蛋白等)，有報道表明0. 0001%~0. 02%即可對生物制品起到有效抑菌作用。硫柳汞在體 內(nèi)能被代謝變成二乙基汞和硫基水楊酸鹽，乙基汞能夠通過腸道被積極排除出去，而不像 甲基汞那樣在體內(nèi)積累發(fā)生毒性反應。疊氮鈉是一種常用于生物試劑或溶液保存的防腐 劑，但它對熱不穩(wěn)定，水溶液遇酸放出劇毒的HN 3，和氰化物相似，對細胞色素氧化酶和其它 酶有抑制作用。因此，與疊氮鈉相比，硫柳汞作為防腐劑毒性更低、更為安全，對環(huán)境污染更 小。
[0006]
[0007] 目前，申請人在研發(fā)熒光定量PCR體系配方試驗中添加有一系列低濃度的硫柳汞 作為防腐劑，通過實驗結果意外發(fā)現(xiàn)，添加硫柳汞不但能起到防腐劑的作用，它還能與海藻 糖、聚乙二醇、甘油等已知的PCR增強劑起到"協(xié)同增強作用"，提高PCR反應的擴增效率及 靈敏度。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型熒光定量PCR反應體系配方，提高包括臨床檢測試劑在內(nèi)的 各種核酸類熒光定量PCR檢測試劑的特異性、靈敏度及穩(wěn)定性提供了極大的幫助。
[0008] 經(jīng)分析，硫柳汞對PCR反應的增強作用可能與其含硫環(huán)狀結構有關。對比對PCR 反應具有明顯增強作用的亞砜類物質(zhì)，如tetramethylene sulfoxide,有研究者認為亞砜 類環(huán)狀結構化合物的獨特作用效果可能是由于其破壞了模板DNA大溝和小溝里帶有供體 和受體互補氫鍵的理想構象，也有可能其通過限制DNA鏈的自由旋轉而使得DNA骨架的相 鄰基團間位間排斥減小。另外，對比對PCR有增強作用的物質(zhì)L-ectoine和homoectoine， 在六元環(huán)上均有一羧基存在,硫柳汞與它們有類似結構。
[0009] 對比觀察硫柳萊、L_ectoine、Homoectoine 和 tetramethylene sulfoxide 的結構 式如下：



【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供硫柳汞作為一種新型增強劑在熒光定量PCR中的應用。硫 柳汞在熒光定量PCR反應液中具有增加反應靈敏度、特異性和提升熒光值的效果，單獨添 加時起到"增強劑"的作用，配合其他試劑添加時起到"協(xié)同增強劑"的作用。
[0013] 硫柳汞作為協(xié)同增強劑時，所述反應液還包含有甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸銨 和氯化銨中的一種或多種。
[0014] 甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸銨和氯化銨等在熒光定量PCR中，作為反應增強劑 能促進耐熱DNA聚合酶對高GC含量的DNA模板的有效擴增，增加 PCR反應的特異性及靈敏 度。其原理主要有通過降低DNA二級結構、提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性等機制而達到提高 目標片段擴增率。其中，海藻糖有助于提高GC含量及片段DNA的擴增。質(zhì)量分數(shù)為2%-10% 的甘油能增加酶的穩(wěn)定性，提高擴增效率。氯化銨或硫酸銨能增加反應配方的離子強度，通 過改變退火溫度來間接調(diào)節(jié)酶活。聚乙二醇能改變引物與模板配對反應的溶解溫度，進而 改善高GC含量DNA的變形情況，使耐熱DNA聚合酶更容易在二級結構處延伸。
[0015] 經(jīng)申請人實驗推測，硫柳汞是通過與【背景技術】部分結構類似的增強劑相似的機理 發(fā)揮作用，實踐中可根據(jù)需要，選擇一種或多種增強劑與其相配合。
[0016] 進一步，所述反應液還包含有耐熱DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5'-3'聚合酶 活性和5' -3'外切酶活性，如Taq DNA聚合酶；所述DNA聚合酶還可以是具有5' -3'聚合 酶活性和3' -5'校正活性的DNA聚合酶，如pfu。
[0017] 上述耐熱DNA聚合酶優(yōu)選熱啟動DNA聚合酶，包括化學修飾、抗體修飾或配基修飾 (DNA酶抑制劑，以及單鏈或雙鏈寡核苷酸抑制物修飾)的DNA聚合酶。熱啟動DNA聚合酶在 常溫至50°C范圍聚合酶活性被封閉，因此，可以有效抑制由于引物與模板非特異性結合，或 引物聚體引起的非特異性擴增，從而增加反應的特異性和靈敏度，以及反應體系的穩(wěn)定性。
[0018] 本發(fā)明還提供一種包含有硫柳汞的定量PCR反應液，所述反應液包含的組分終濃 度(未注明濃度單位的均為質(zhì)量濃度）：IO-IOOmM Tris-HCl，PH7. 7-9. 0、0. 0001-0. 01%的硫 柳汞，1-10% 的 PEG4000 或 100-600mM 海藻糖，0-50mM 或 O-IOOmM KCl，0-50mM(NH4)2S04 或 順4(：1，0.2-0.41111(1犯13,2-1211111%2+，2-10%甘油和0.01-0.21]/^1熱啟動0嫩聚合酶。
[0019] 上述反應液所包含的組分終濃度，作為優(yōu)選的，硫柳汞為0. 004-0. 006%，海藻糖為 180-220mM，PEG4000 為 2-8%，（NH4)2SO4 或 NH4Cl 為 10-30mM，MgCl2 為 2-8mM，甘油為 5-10%， 熱啟動DNA聚合酶為0.08-0. 12U/μ 1。
[0020] 本發(fā)明還涉及一種熒光定量PCR試劑盒，所述試劑盒包含上述含有硫柳汞的任何 一種反應液。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明涉及硫柳汞的一種新用途，對于PCR反應而言，其除了 能作為防腐劑提高反應液的穩(wěn)定性之外，還能單獨或與其他PCR增強劑一起協(xié)同提高PCR 反應的擴增效率、靈敏度，以及增加熒光值。另外，本發(fā)明的反應液配方避免了常規(guī)PCR體 系配方中因添加其他劇毒防腐劑，如疊氮鈉等帶來的環(huán)境污染的弊端，為開發(fā)硫柳汞在新 的領域中的應用奠定了基礎。
【附圖說明】
[0022] 圖1熒光定量PCR探針法擴增曲線圖；
[0023] I (配方1):優(yōu)化前體系的擴增曲線
[0024] II (配方2):單獨加入硫柳汞的擴增曲線
[0025] III (配方3):單獨加入海藻糖的擴增曲線
[0026] IV (配方4):同時加入硫柳汞和海藻糖的擴增曲線
[0027] 圖2四種反應體系Ct值比較；
[0028] 圖3四種反應體系熒光值比較；
[0029] 圖4熒光定量PCR SYBR Green染料法擴增曲線圖；
[0030] I (配方5):優(yōu)化前體系的擴增曲線
[0031] II (配方6):單獨加入PEG4000的擴增曲線
[0032] IIK配方7):單獨加入硫柳汞的擴增曲線
[0033] IV (配方8):同時加入硫柳汞和PEG4000的擴增曲線
[0034] 圖5四種反應體系Ct值比較；
[0035] 圖6四種反應體系熒光值比較。
【具體實施方式】
[0036] 以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細描述。優(yōu)選實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。實施例中所用的試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均 為可以通過市面購到的常規(guī)產(chǎn)品。下文未注明濃度單位的均為質(zhì)量濃度。
[0037] 實施例1熒光定量PCR Taqman探針法比較