通過氧化裂解從長鏈脂肪酸生產(chǎn)7-碳化學(xué)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及使用一種或多種分離的酶例如合成酶、脫氨酶、還原酶、脫水酶、硫醋 酶、單加氧酶或轉(zhuǎn)氨酶，或使用表達(dá)一種或多種運(yùn)些酶的重組宿主細(xì)胞，生物合成W下 一種或多種物質(zhì)的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-徑基庚酸、庚二胺和1，7-庚二醇（下文稱 為"C7結(jié)構(gòu)單元"）。 陽00引發(fā)明背景
[0003] 尼龍是聚酷胺，其一般通過二胺與二簇酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過內(nèi) 酷胺的縮聚生成。一種無處不在的尼龍是尼龍6,6,其通過六亞甲基二胺（HMD)和己 二酸的反應(yīng)生成。尼龍6可通過己內(nèi)酷胺的開環(huán)聚合生成（Anton&Baird,Polyamides Fibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology, 2001)。
[0004] 尼龍7和尼龍7, 7代表與尼龍6和尼龍6, 6相比具有增值特征的新型聚酷胺。尼 龍7是通過7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龍7, 7是通過庚二酸和庚二胺的縮聚生成的。不 存在生成用于尼龍7和尼龍7, 7的單體的經(jīng)濟(jì)上可行的石油化學(xué)路徑。 陽0化]鑒于沒有經(jīng)濟(jì)上可行的石油化學(xué)單體給料；生物技術(shù)提供了一種經(jīng)由生物催化的 備選方法。生物催化是使用生物催化劑（諸如酶）來實(shí)施有機(jī)化合物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。
[0006] 生物衍生給料和石油化學(xué)給料兩者是用于生物催化過程的可行起始材料。
[0007] 因而，針對(duì)此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-徑基庚酸、7-氨基庚酸、庚 二胺和1，7-庚二醇化巧tanediol)(下文為"C7結(jié)構(gòu)單元"）中一種或多種的適宜方法，其 中所述方法是基于生物催化劑的。
[0008] 然而，無野生型原核生物或真核生物天然過度生成運(yùn)類C7結(jié)構(gòu)單元或?qū)⑵渑懦?至胞外環(huán)境。不過，已經(jīng)報(bào)告了庚二酸的代謝。
[0009] 二簇酸庚二酸作為碳源經(jīng)由P-氧化被眾多細(xì)菌和真菌有效轉(zhuǎn)化成中屯、代謝 物。輔酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的P-氧化經(jīng)由例如與芳香 族底物降解有關(guān)的途徑促進(jìn)進(jìn)一步代謝。已經(jīng)廣泛表征了3-氧代庚二酷基-CoA被幾種 細(xì)菌分解代謝成乙酷基-CoA和戊二酷基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最優(yōu)性原理陳述微生物調(diào)節(jié)其生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)W支持最大生物量生長。超出宿主 生物體中表達(dá)異源路徑的需要，將碳流量引向充當(dāng)碳源而非充當(dāng)生物量生長成分的C7結(jié) 構(gòu)單元與最優(yōu)性原理矛盾。例如，與天然生產(chǎn)者的產(chǎn)量性能相比，將1-下醇途徑從梭菌 (Clostridium)物種轉(zhuǎn)移入其它生產(chǎn)菌株中經(jīng)常下降一個(gè)數(shù)量級(jí)（化en等，Appl.Environ. Microbiol.，2011，77巧）：2905 - 2915)。
[0011] 在C7脂肪族主鏈上形成末端官能團(tuán)（諸如簇基、胺或徑基基團(tuán)）前，7碳脂肪族主 鏈前體的有效合成是合成一種或多種C7結(jié)構(gòu)單元中的重要考慮因素。 陽〇1引發(fā)明概述
[0013] 本申請至少部分地基于W下發(fā)現(xiàn)：可構(gòu)建用于生產(chǎn)屯碳鏈?zhǔn)街逯麈溓绑w例如庚 二酷-[acp]或庚酸的生物化學(xué)途徑，在所述屯碳鏈?zhǔn)街逯麈溓绑w中可形成一個(gè)或兩個(gè) 官能團(tuán)，例如簇基、胺或者徑基，導(dǎo)致W下一種或者多種物質(zhì)的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、 7-徑基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇（下文稱為"C7結(jié)構(gòu)單元")。庚二酸和庚二酸鹽（醋）， 7-徑基庚酸和7-徑基庚酸鹽（醋），7-氨基庚酸和7-氨基庚酸鹽（醋）本文中可替換使 用，指代W其任意中性或離子化形式的化合物，包括其任意的鹽形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解具體的形式將依賴于pH。本文描述的運(yùn)些途徑、代謝工程和培養(yǎng)策略依賴于脂肪酸 合成酶或其同源物，W及來自于微生物例如枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)的biol編 碼的細(xì)胞色素P450。Biol是細(xì)胞色素P450CYP107H家族中的單加氧酶。
[0014] 面對(duì)最優(yōu)性原理，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可將適當(dāng)?shù)姆翘烊煌緩健⒔o料、宿主微生物、對(duì) 宿主的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化策略和培養(yǎng)策略組合起來，從而高效地生產(chǎn)一種或多種C7結(jié) 構(gòu)單元。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化為C7結(jié)構(gòu)單元的C7脂族主鏈可W從長鏈酷 基-[acp]例如十四酷-[acp]形成，其由Biol編碼的單加氧酶在脂肪酸合成中產(chǎn)生。見圖 1〇
[0016] 在一些實(shí)施方案中，可W使用硫醋酶、醒脫氨酶、7-氧代庚酸脫氨酶，或6-氧代己 酸脫氨酶酶促形成末端簇基。見圖2。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，可W使用轉(zhuǎn)氨酶或者脫乙酷基酶酶促形成末端胺基。見 圖3和圖4。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，可W使用單加氧酶或醇脫氨酶酶促形成末端徑基。見圖5和 圖6。
[0019] 在一個(gè)方面，本申請的特征在于生物合成選自下組的產(chǎn)物的方法：庚二酸、7-氨 基庚酸、7-徑基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇。所述方法包括從長鏈酷基-[acp]中間物酶 促合成兩個(gè)屯碳鏈?zhǔn)街逯麈?，W及在一條或兩條所述主鏈中酶促形成一個(gè)或兩個(gè)選自簇 基、胺和徑基的末端官能團(tuán)，從而形成所述產(chǎn)物。所述屯碳脂族主鏈可W是庚二酷-[acp] 或庚酸。庚二酷-[acp]和庚酸可W通過脂肪酸合成W及由Biol編碼的單加氧酶對(duì)長鏈酷 基-[acp]中間物的氧化裂解從乙酷-CoA和丙二酷-CoA酶促合成。
[0020] 所述兩個(gè)末端官能團(tuán)可W是相同的（例如胺或徑基），或者可W是不同的（例如一 個(gè)末端胺和一個(gè)末端簇基；或一個(gè)末端徑基和一個(gè)末端簇基）。
[0021] 轉(zhuǎn)氨酶或者脫乙酷基酶可W酶促形成胺基。所述轉(zhuǎn)氨酶可W與列于SEQ IDNO. 8-13中的任一氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0022] 6-徑基己酸脫氨酶、5-徑基戊酸脫氨酶、4-徑基下酸脫氨酶、醇脫氨酶或單加氧 酶能夠酶促形成徑基基團(tuán)。單加氧酶可W與列于SEQIDNO: 14-16中的任一氨基酸序列具 有至少70 %的序列同一性。
[0023] 硫醋酶、醒脫氨酶、7-氧代庚酸脫氨酶、6-氧代己酸脫氨酶、CoA-轉(zhuǎn)移酶（例如戊 締二酸CoA轉(zhuǎn)移酶）、或可逆CoA-連接酶（例如可逆班巧酸-CoA連接酶）可W酶促形成末 端簇基。所述硫醋酶可W與列于SEQIDNO: 1中的氨基酸序列具有至少70%的序列同一 性。
[0024] 簇酸還原酶和憐酸泛酷琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶能夠形成末端醒基，作為形成所述產(chǎn)物 的中間物。所述簇酸還原酶可W與列于SEQIDNO. 2-7中的任一氨基酸序列具有至少70% 的序列同一性。
[00巧]任意所述方法可w通過發(fā)酵在重組宿主中進(jìn)行。所述宿主可W經(jīng)受需氧或微氧的 培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略。所述宿主可W在營養(yǎng)限制的條件下培養(yǎng)。所述宿主可W使用陶瓷 中空纖維膜保留W維持發(fā)酵期間的高細(xì)胞密度。
[00%] 在任意所述方法中，宿主對(duì)高濃度C7結(jié)構(gòu)單元的耐受可W通過在選擇環(huán)境中連 續(xù)培養(yǎng)來改善。
[0027] 進(jìn)料至發(fā)酵的主要碳源可W衍生自生物或非生物給料。在一些實(shí)施方案中，所述 生物給料是W下物質(zhì)，包括W下物質(zhì)，或衍生自W下物質(zhì)：單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維 素、纖維素、木質(zhì)素、乙酷丙酸和甲酸、甘油=醋、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮的酒糟可溶 物或城市廢物。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述非生物給料是W下物質(zhì)，或衍生自W下物質(zhì)：天然氣、合 成氣、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、來自環(huán)己燒氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或者堿洗 廢物流，或?qū)Ρ蕉姿?異獻(xiàn)酸混合物廢物流。
[0029] 本申請的特征還在于重組宿主，其包含至少一種編碼由Biol編碼的單加氧酶 (CYP107H家族）和醒脫氨酶的外源性核酸，所述宿主生產(chǎn)庚二酷-[acp]和庚酸。所述宿 主可W包括一種或多種W下物質(zhì)：單加氧酶（例如，CYP153家族）、硫醋酶、醒脫氨酶、6-徑 基己酸脫氨酶、5-徑基戊酸脫氨酶、4-徑基下酸脫氨酶、6-氧代己酸脫氨酶、7-氧代庚酸脫 氨酶，或簇酸還原酶。所述宿主生產(chǎn)庚二酸、庚二酸半醒，或7-徑基庚酸。在任意表達(dá)簇酸 還原酶的重組宿主中，還可W表達(dá)憐酸泛酷琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶來提高所述簇酸還原酶的活 性。在任意表達(dá)單加氧酶的重組宿主中，還可W表達(dá)電子轉(zhuǎn)移鏈蛋白例如氧化還原酶和/ 或鐵氧化還原蛋白多膚。
[0030] 生產(chǎn)庚二酸半醒、7-徑基庚酸，或7-氨基庚酸的重組宿主進(jìn)一步可W包括W下一 種或多種酶：簇酸還原酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫乙酷基酶、N-乙酷轉(zhuǎn)移酶，或醇脫氨酶，所述宿主 生產(chǎn)庚二胺。
[0031] 生產(chǎn)庚二酸半醒的重組宿主進(jìn)一步可W包括轉(zhuǎn)氨酶，并生產(chǎn)7-氨基庚酸。
[0032] 生產(chǎn)7-徑基庚酸的重組宿主進(jìn)一步可W包括簇酸還原酶或醇脫氨酶，所述宿主 生產(chǎn)1,7-庚二醇。
[0033] 所述重組宿主可W是原核生物，例如來自埃希氏菌屬（Escherichia)如大 腸桿菌巧scherichiacoli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungd址lii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或者克魯佛梭 菌（Clostridiumkluyveri);來自棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacteriumglutami州m);來自貪銅菌屬（Qipriavidus)如鉤蟲貪銅菌 (Qipriavidusnecator)或者耐金屬貪銅菌（Qipriavidusmetallidurans);來自假單 胞菌屬（Pseudomonas)如巧光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)或者食油假單胞菌（Pseudomonasoleavorans);來自代爾夫特菌 屬值elftia)如食酸代爾夫特菌值elftiaacidovorans);來自芽抱桿菌屬度acillus) 如枯草芽胞桿菌度acillussubtillis);來自乳桿菌屬（Lactobacillus)如德氏乳桿 菌（Xactobacillusde化rueckii);或者來自乳球菌屬（Xactococ州S)如乳酸乳球菌 (Xactococ州Slactis)或來自紅球菌屬巧hodococcus)如馬紅球菌巧hodococcusequi)。 W34] 所述重組宿主可W是真核生物，例如，來自曲霉屬（Aspergi1lus)如黑曲 霉（Aspergillusniger);來自酵母屬（Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤氏酵屬（Pichia)如己斯德畢赤酵母（Pichiapastoris);來自 耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowialipolytica);來自伊薩 酵母屬（Issatchenkia)如東方伊薩酵母（Issathenkiaorientalis);來自德己利酵母 屬值ebaryomyces)如漢遜德己利酵母值ebaryomyceshansenii);來自Arxula屬如 Arxulaadenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌屬化luyveromyces)如乳酸克魯維酵母 菌化luyveromyceslactis)的真核生物。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，弱化或增強(qiáng)所述宿主的內(nèi)源性生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，來（1)保證乙 酷-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度，（2)創(chuàng)造NADH不平衡，其僅可通過C7結(jié)構(gòu)單元的形成平衡，（3) 阻止通向并包括C7結(jié)構(gòu)單元的中屯、代謝物和中屯、前體的降解和（4)保證從細(xì)胞的高效流 出。
[0036] 本文所述的任意重組宿主進(jìn)一步可W包括一種或多種W下減毒酶：聚徑基鏈燒酸 醋合酶、乙酷-CoA硫醋酶、乙酷-CoA特異性P-酬硫解酶；形成乙酸的憐酸轉(zhuǎn)乙酷酶、乙 酸激酶、乳酸脫氨酶、甲基糞釀（menaquinol)-延胡索酸氧化還原酶、產(chǎn)生異下醇的2-酬 酸脫簇酶、產(chǎn)生乙醇的醇脫氨酶、憐酸丙糖異構(gòu)酶、丙酬酸脫簇酶、葡萄糖-6-憐酸異構(gòu)酶、 NADPH-消耗型轉(zhuǎn)氨酶、NADH-特異性谷氨酸脫氨酶、NADH/NADPH利用型谷氨酸脫氨酶、庚二 酷-CoA脫氨酶；接受C7結(jié)構(gòu)單元和中屯、前體作為底物的酷基-CoA脫氨酶；戊二酷-CoA脫 氨酶；或庚二酷-CoA合成酶。
[0037] 本文所述的任意重組宿主進(jìn)一步可W過表達(dá)編碼W下物質(zhì)的一種或多種基因：乙 酷-CoA簇化酶、乙酷-CoA合成酶、6-憐酸葡萄糖酸脫氨酶；轉(zhuǎn)酬醇酶；化晚核巧酸轉(zhuǎn)氨酶； 甘油-3P-脫氨酶；蘋果酸酶；葡萄糖-6-憐酸脫氨酶；果糖1，6二憐酸酶山-丙氨酸脫氨 酶；NADPHk谷氨酸脫氨酶；二胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；二簇酸轉(zhuǎn)運(yùn)體；和/或多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[003引本文所述途徑的反應(yīng)可W在一種或多種細(xì)胞（例如宿主細(xì)胞）株中進(jìn)行，所述細(xì) 胞株（a)天然表達(dá)一種或多種相關(guān)酶，化）經(jīng)遺傳工程化而表達(dá)一種或多種相關(guān)酶，或（C) 天然表達(dá)一種或多種相關(guān)酶并經(jīng)遺傳工程化而表達(dá)一種或多種相關(guān)酶。或者，可W從W上 任意類型的宿主細(xì)胞中提取相關(guān)酶，并W純化或半純化形式使用。提取的酶可選地固定在 固體基質(zhì)上，例如適合的反應(yīng)容器的底和/或壁。此外，運(yùn)些提取物包括可W作為相關(guān)酶來 源使用的裂解物（如細(xì)胞裂解物）。在本申請?zhí)峁┑姆椒ㄖ?，所有步驟可W在細(xì)胞（例如宿 主細(xì)胞）中進(jìn)行，所有步驟可W使用提取的酶進(jìn)行，或一些步驟可W在細(xì)胞中進(jìn)行，而其它 步驟可W使用提取的酶進(jìn)行。
[0039] 本文所述的多種酶催化可逆反應(yīng)，并且感興趣的反應(yīng)可W是所述反應(yīng)的逆反應(yīng)。 圖1-6所示的示意性途徑闡明了對(duì)于每種中間物感興趣的反應(yīng)。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，弱化或增強(qiáng)所述宿主微生物的內(nèi)源性生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，來（1) 保證乙酷-CoA和丙二酷-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度，（2)創(chuàng)造NADPH不平衡，其僅可通過脂肪酸 合成和C7結(jié)構(gòu)單元的形成平衡，（3)阻止通向并包括C7結(jié)構(gòu)單元的中屯、代謝物和中屯、前 體的降解，和（4)保證從細(xì)胞的高效流出。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)策略需要阻止脂肪酸整合到脂質(zhì)體或其它碳存儲(chǔ)單 元中。
[0042] 除非另外定義，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的定義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。雖然與本申請所述的方法和材料相似或者等同的方法 和材料也可用于實(shí)踐本發(fā)明，但在下文描述適合的方法和材料。本文提及的所有公開、專利 申請、專利和其它參考文獻(xiàn)通過提述完整并入本文。在沖突的情況下，W本說明書包括定義 為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為示例性的而不意圖限制。
[0043] 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)列于下面的附圖和描述中。根據(jù)說明書和附 圖，并根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。根據(jù)專利法的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐， 詞語"包含"在權(quán)利要求中可被"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。
[0044] 附圖簡述 陽045] 圖1是使用十四酷-[acp]作為長鏈脂肪酸中屯、代謝物通向庚二酷-[acp]和庚酸 的示例性生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0046] 圖2是使用庚二酷-[acp]和庚酸作為中屯、前體通向庚二酸的示例性生物化學(xué)途 徑的示意圖。
[0047] 圖3是使用庚二酷-[acp]和庚酸作為中屯、前體通向7-氨基庚酸的示例性生物化 學(xué)途徑的示意圖。
[0048] 圖4是使用7-氨基庚酸、7-徑基庚酸或庚二酸半醒作為中屯、前體通向庚二胺的示 例性生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0049] 圖5是使用庚二酷-[acp]和庚酸作為中屯、前體通向7-徑基庚酸的示例性生物化 學(xué)途徑的示意圖。
[0050] 圖6是使用7-徑基庚酸作為中屯、前體通向1，7-庚二醇的示例性生物化學(xué)途徑的 示意圖。
[0051] 圖7含有由tesB編碼的大腸桿菌硫醋酶（見GenBank登錄號(hào)AAA24665. 1,SEQ IDNO: 1)、海分枝桿菌（Mycobacteriummarinum)簇酸還原酶（參見GenBank登錄號(hào) ACC40567. 1，沈QIDN0:2)、恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis)簇酸還原酶（參 見GenBank登錄號(hào)ABK71854. 1，SEQIDN0:3)、Se即iliparusrugosus簇酸還原酶（參見 GenBank登錄號(hào)EFV11917.1，SEQIDN0:4)、恥垢分枝桿菌簇酸還原酶（參見GenBank登錄 號(hào)ABK75684.1，沈QIDN0:5)、馬賽分枝桿菌（Mycobacteriummassiliense)簇酸還原酶 (參見GenBank登錄號(hào)EIV11143.1，SEQIDN0:6)、Se即iliparusrotundus簇酸還原酶（參 見GenBank登錄號(hào)ADG98140. 1，SEQIDN0:7)、紫色色桿菌（Qiromobacteriumviolaceum) w-轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號(hào)AAQ59697.1，SEQIDN0:8)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ?-轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號(hào)AAG08191. 1，沈QIDN0:9)、下香假單胞菌 (Pseudomonassyringae)"-轉(zhuǎn)氨酶（參見GenBank登錄號(hào)AAY39893.1，沈QIDN0:10)、球 形紅桿菌巧hodobactersphaeroides) ?-轉(zhuǎn)