衍生自黑曲霉的新型葡萄糖氧化酶的制作方法
【專利說明】衍生自黑曲霉的新型葡萄糖氧化酶 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明設及新型葡萄糖氧化酶變體。本文提供的葡萄糖氧化酶對于底物葡萄糖特 異性，并且從而顯示出顯著降低的耗氧率。在另一個方面，本發(fā)明提供了葡萄糖氧化酶，其 對于底物葡萄糖特異性，并且從而顯示出顯著降低的耗氧率和/或對于除氧外的電子介質 增加的酶促活性。進一步地，本發(fā)明設及用于測量葡萄糖的試劑盒和傳感器中的所述葡萄 糖氧化酶。
[0002] 特別地，本發(fā)明設及衍生自黑曲霉（心公6巧77扣5 如r)的葡萄糖氧化酶，除根據(jù) 沈QIDNO: 1的兩個置換T30V和I94V之外，另外具有在選自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ; 和V560的六個位置中的至少一個氨基酸置換。
[0003] 科學背景 糖尿病反映可W在全世界廣泛發(fā)現(xiàn)的代謝疾病。糖尿病患者具有受損或缺失的激素膜 島素產(chǎn)生，所述膜島素控制血糖水平，并且因此在不足夠的膜島素應用的情況下，運些患者 具有高血糖癥W及低血糖癥的危險你e打心。〇/7ant/化3抑asis〇/化sAe沁S曲加？ and intermediate hyperglycaemia. WHO,and IDF (2006);肥0 Document Production service ISBN 9241594934]。
[0004] 為了確保膜島素的正確應用，高度特異性、準確和容易處理的葡萄糖測量系統(tǒng)是 自測量系統(tǒng)和臨床規(guī)模上的高流通量測量系統(tǒng)兩者所需的。
[0005] 為了允許血液中的葡萄糖濃度的準確測定并且使得測量高度特異性，設及酶促反 應。目前，在糖尿病分析中使用的兩類酶由葡萄糖脫氨酶(下文GDH)和葡萄糖氧化酶(下 義G&k)反巧k [冊nes, J.，伽ller,和Surridge, N. (2008).The T'echnology Behind Glucose Meters: Test Strips. DIABETES TECHNOLOGY & T皿RAPEUTICS 10,10-26]。
[0006] GDH的主要優(yōu)點在于它的氧不依賴性葡萄糖氧化，但該酶顯示對某些其他臨床相 關糖的輕微副活性，并且因此GDH是非特異性的仍_7別如0177,乂乂游化i打6,乂乂做;. On the mechanism and specificity of soluble,quinoprotein glucose dehydrogenase in the oxidation of aldose sugars. Biochemistry 37，13854-13861]。相之下，GOx 對于葡萄糖高度特異性，但它的氧化是強氧依賴性的/化M左a。5：么，化/知，瓜K，57端'AgA R. S.和Ananthanarayan，L. (2009). Glucose oxidase-an overview. Biotechnology Advances 27,489-501; Bentley, R.和化uberger, A. (1949).The mechanism of the action of notation. Biochem J 45，584-590]。
[0007] 更詳細地，G化作為黃素蛋白屬于氧化還原酶（即P-D-葡萄糖：氧1-氧化還原 酶）家族。通過采用分子氧作為電子受體，天然或野生型（下文WT)G化催化P-D-葡萄糖 氧化為D-葡糖酸-5 -內醋和&〇2 /參屈嫁妨，化乂度游必邸公6,足."化斯.巧e Oxidation of Glucose and Related Compounds by Glucose Oxidase from Aspergillus 化〇〇/?6化/5的^義旅$*-5'況?7。所述反應由下式描述： D-葡萄糖+ 〇2 -葡糖酸內醋+ &〇2 G化的底物可W分成兩組：i)氧化半反應的電子受體，和ii)還原半反應的電子供體， 參嘴獻艦[Leskovac，V.，Trivic，S.，Wohlfalrrt，G.，Kandrac，J?和Pericin，D. (2005) ?GlucoseoxidasefromAspergillusniger:themechanismofactionwithmolecular oxygen，quinones，andone-electronacceptors,IntJBiochemCellBiol37， 7J7-7沉?7。本領域技術人員應認識到，除了D-葡萄糖之外，多種D-葡萄糖衍生物是GOx的 還原半反應的潛在底物。
[000引迄今為止已描述了來自不同起源的GOx。例如，來自海藻皺波角叉萊瓜W化AS。打5'所/5)的6(^在服7,544,795和服6,924,366中得到描述；來自絲狀真菌枝抱屬物種 (C知施邱ori拙7邱ec.)的GOx在W0 95/29996 ;W0 1998/020136中得到描述；并且來自黃 藍狀菌（沾知巧TC6W 的GOx在US6, 054, 318中得到描述D
[0009] 在文獻中最佳描述的GOx來自黑曲霉/觀cAf，原乂，況命孤Ayr夢，公.，侶，原 和Schmid，民.D. (1993) ?The3DstructureofglucoseoxidasefromAspergillus niger.ImplicationsfortheuseofGODasabiosensorenzyme.Biosensors &Bioelectronics8，197-203;Wohlfahrt，G.，Witt，S.，Henclle，J.，Schomburg，D.， Kalisz，H.M?和Hecht，H.J. (1999) ? 1. 8and1. 9Aresolutionstructuresofthe Penici11iumamagasakienseandAspergillusnigerglucoseoxidasesasabasis formodellingsubstratecomplexes.ActaCrystallographicaSectionDBiological Ciystallography55,969-977]。
[0010] W089/126675描述了在重組系統(tǒng)中來自黑曲霉的GOx的生產(chǎn)，并且wo 2008/079227A1涉及在賦予改善的膽存穩(wěn)定性的組合物中配制的得自黑曲霉的GOx。
[0011] 它是充分表征的蛋白質，形成大小160kDa的二聚體，并且其晶體結構已得到解決 [Hecht，比J.等人，Crystal-StructureOfGlucose-OxidaseFromAspergillus-Niger RefinedAt2. 3AngstromResolution.JournalOfMolecularBiology，1993. 229(1): 第 153-172頁]。
[001引進一步已知，特別地，黑曲霉的野生型GOx(下文GOx-WT)顯示出顯著的溫度穩(wěn)定 性和對于底物葡萄糖的特異性。GOx是具有10-16%的高甘露糖型碳水化合物含量的糖蛋 皆化ayashi，S.和Nakamura，S. (1981) ?Multipleformsofglucoseoxidasewith differentcarbohydratecompositions.BiochimBiophysActa657,40-51;Pazur，J, H.，Kleppe，K.和Cepure，A. (1965).Aglycoproteinstructureforglucoseoxidase fromAspergillusniger.ArchBiochemBiophys111，351-357]。
[0013] 目前，GOx通常用于檢測工業(yè)溶液或受試者體液(例如血液和尿）中的葡萄糖的生 物傳感器中。
[0014] 目前可用的自測量裝置中的大多數(shù)是原則上由下述組成的電化學傳感器： a) 生物組分，即具有葡萄糖作為底物的各種酶， b) 指示器（電子元件)，和 C)信號轉換器。
[0015] 在測量裝置中，來自葡萄糖的電子經(jīng)由介質通過生物組分（a)轉移到電極（b)。信 號轉換器（C)隨后將電子信號轉換成實時葡萄糖濃度，其與轉移的電子量成比例。
[0016] 除了上述電化學傳感器之外，還存在可用的光測傳感器。此處的差異是來自葡萄 糖的電子轉移到氧化還原指示劑染料(充當指示劑)。光度測量所得到的還原染料的變色。
[0017] 另一種主要應用可能變成(X)x在植入和小型化的生物燃料電池的陽極區(qū)室中的 用途，所述生物燃料電池燃燒來自血流的葡萄糖，并且從而給微型診斷裝置或累提供動力。
[0018] 此外，G化在食品工業(yè)中的應用是眾多的，因為它生成過氧化氨的能力，所述過氧 化氨具有抗微生物效應，可W用于改善某些食物產(chǎn)品的膽存穩(wěn)定性，所述食物產(chǎn)品包括例 如奶酪、黃油和果汁。
[0019] G化在化妝品組合物中的應用同樣可W利用抗微生物特性。己糖氧化酶在藥物和 化妝品組合物中的潛在用途例如在S6, 924, 366;US6, 251，626和W0 2007/045251A2中 提出。
[0020] 此外，G化的用途在轉基因植物及其他生物的生產(chǎn)中提出，所述轉基因植物及其他 生物對于害蟲或疾病具有降低的敏感性或增加的抗性(參見例如W0 1995/021924)。
[0021] 然而，依照本發(fā)明，G化在葡萄糖生物傳感器中的用途具有顯著興趣。在運點上， W0 2009/104836A1描述了葡萄糖傳感器，其包含就其附著至金屬表面而改善的遺傳改造 的(X)x變體。
[0022] Zhu等人在2006和2007年描述了在T30V和/或I94V中突變的衍生自黑曲霉 的(X)x突變體。因此，相應的雙重突變體T30V;I94V也已得到描述如/，么，必(畑細，C， Zakhartsev，M.和Schwaneberg，U. (2006).Makingglucoseoxidasefitforbiofuel cellapplicationsbydirectedproteinevolution.BiosensorsandBioelectronics 21,2046-2051;化u,Z. ,Wang,M. ,Gau化m,A.,化zor,J. ,Momeu,C. ,R,P. ,andU,S. (2007).DirectedevolutionofglucoseoxidasefromAspergillusnigerfor ferrocenemethanol-mediatedelectrontransfer.BiotechnologyJournal2,241-248] (下文Zhu等人（2006/2007)。
[002引具體地，具有置換T30V和I94V的上述雙重突變體在酶活性中輕微增加（keat從 69. 5/s到137. 7/s)，與(X)x-WT相比較，顯示出在58°C至62°C范圍內增加的熱穩(wěn)定性，化及 在8至11范圍內改善的抑穩(wěn)定性。然而，與GOx-WT相比較，所述衍生自黑曲霉的雙重突 變體顯不出相等的耗氧率。
[0024] EP2 415 863A1描述了核酸分子及其多膚，其具有(X)x活性，但在下述氨基酸 位置2、13、30、94和152中的至少S個中突變。特別地，除在釀酒酵母巧rces cereWsiae)中增加的表達水平之外，還具有置換N2Y、K13E、T30V、I94V和K152R的EP2 415 863A1的M12變體顯示出對于作為電子受體的氧增加兩倍的活性。
[0025]Hora邑uchi等K陽oraguchi,Y.，Saito,S.，F(xiàn)erri,S.，Mori,K.，Kojima, K. ,Tsugawa,W.和Sode,K. (2012).TurningGlucoseOxidaseintoEssentially Dehydrogenase.Meet.Abstr. ,]hhmeMA2012-02,Is洲e18,Pages2057]化年 鑒定了設及本文描述的(X)x變體的氧化半反應的一個氨基酸殘基位置，它是尼崎青霉 (化曲洗S3心ease)的GOx和黑曲霉的GOx變體。所述一個位置是尼崎青霉GOx 變體的S114和黑曲霉變體的相應T110。兩個位置均替換為氨基酸丙氨酸，導致對于作為電 子受體的氧活性中的減少。例如，黑曲霉的(X)x變體顯示出降低6. 6倍的耗氧量，并且因此 除363%的介質活性之外，還具有30. 4%的殘留氧活性。
[002引本發(fā)明的根本問題 對于葡萄糖非特異性的GM1和氧依賴性的(X)x代表目前葡萄糖測量系統(tǒng)的關鍵酶。
[0027] 在本公開內容的上下文中，表達"對于葡萄糖非特異性"、"氧依賴性的"和"氧依賴 性"具有如定義部分中所述的含義。
[0028] 本發(fā)明的根本問題的解決方案 本發(fā)明的根本問題的解決方案是提供衍生自真菌黑曲霉的特別修飾且因此優(yōu)化的GOx變體。
[0029] 令人驚訝和出乎意料地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)衍生自黑曲霉的新型(X)x變體對于葡萄 糖特異性，但不依賴于氧用于葡萄糖氧化且因此對于葡萄糖測量更準確。
[0030] 此外，令人驚訝和出乎意料地，本發(fā)明提供了新型(X)x變體，其對于葡萄糖特異 性，并且從而顯示出顯著降低的耗氧率和/或對于除氧外的電子介質顯著增加的介質活 性。
[003。 本發(fā)明的主題是新型6化變體，除根據(jù)SEQIDNO: 1的兩個置換T30V和I94V之 夕b其另外具有在選自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六個位置中的至少一個氨基 酸置換。
[0032] 在本公開內容的上下文中，表達"對于葡萄糖的酶特異性"或"對于葡萄糖特異性" 指示：當通過如條目ff)下的材料與方法中概述的介質測定進行測定時，本文提供的(X)x對 于底物葡萄糖〉99. 5%或〉99. 9%，特別是100%的活性。言下之意，當通過如條目ff)下的 材料與方法部分中概述的介質測定進行測定時，本文提供的(X)x對于除葡萄糖外的糖例如 半乳糖、麥芽糖、木糖和麥芽=糖的殘留活性< 6%。
[0033] 在本公開內容的上下文中，表達"顯著降低的耗氧率"指示：當如根據(jù)條目gg)下 的材料與方法部分中概述的ABTS測定，通過生色底物ABTS的氧化間接測定氧依賴性時，本 文提供的(Xk變體經(jīng)過3分鐘的時間段〉95%的殘留氧含量。
[0034] 在本公開內容的上下文中，表達"顯著降低的氧活性"或"對于作為電子受體的氧 顯著降低的活性"指示：當通過如條目gg)下的材料與方法部分中概述的ABTS測定進行測 定時，特征在于殘留氧活性《30%、或< 25%、或< 20%，特別是< 15%、或《10%的(X)x活 性。
[0035] 在本公開內容的上下文中，表達"顯著增加的介質活性"或"對于除氧外的電子介 質顯著增加的活性"指示：當通過如條目ff)下的材料與方法部分中概述的介質測定進行 測定時，特征在于根據(jù)SEQIDNO: 1的葡萄糖氧化酶對于除氧外的電子介質增加至少1.5 倍的活性的(X)x活性。
[0036] 因此，本發(fā)明的優(yōu)化(X)x變體適合于植入改善的血糖測量系統(tǒng)中。
[0037] 發(fā)明概述 令人驚訝和出乎意料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如Zhu等人（2006 ;2007)中描述的(X)x雙重突 變體T30V;I94V(下文縮寫為G0X-T30V;I94V)，適合作為進一步的特異性氨基酸置換的基 礎，W獲得氧不依賴性(X)x變體，其具有顯著降低的氧化酶活性和伴隨的顯著增加的脫氨 酶活性，同時保留對于底物葡萄糖的特異性。進一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)依照本發(fā)明的(X)x變 體另外或單獨對于除氧外的電子介質顯示出顯著增加的介質活性。在運點上，本發(fā)明人還 發(fā)現(xiàn)依照本發(fā)明的(X)x變體接受除氧外的某些電子介質用于電子轉移。因此，依照本發(fā)明 的GOx變體適合于改善的葡萄糖測量，特別是改善的血糖測量。
[0038] 在本公開內容的上下文中，表達"接受除氧外的某些電子介質用于電子轉移"指 示：本文提供的(X)x變體與選自下述的介質相互作用且因此接受所述介質用于介導電子轉 移的能力：亞硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗦及其衍生物、吩嚷嗦及其衍生物、吩嗯 嗦及其衍生物、二茂鐵及其衍生物、鐵氯化鐘、Ru-和Os-絡合物、釀及其衍生物、嗎I噪酪、紫 精、四硫富瓦締及其衍生物和獻菁。
[0039] 本發(fā)明設及衍生自黑曲霉的(X)x變體，除根據(jù)SEQIDNO: 1的兩個置換T30V和 I94V之外，其另外具有在選自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六個位置中的至少一 個氨基酸置換。
[0040] 在另一個方面，本發(fā)明設及衍生自黑曲霉的(X)x變體，除根據(jù)SEQIDNO: 1的兩 個置換T30V和I94V之外，其另外具有在選自A173 ;A332 ;F414 ;和V560的四個位置中的至 少一個氨基酸置換。
[0041] 在進一步方面，本發(fā)明設及(X)x變體，其具有在選自根據(jù)SEQIDNO: 1的(X)x的 S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六個位置中的至少兩個、或S個、或四個、或五個或 甚至六個協(xié)同且因此不同的氨基酸置換，導致耗氧率中的顯著減少。
[0042] 進一步地，本發(fā)明設及(X)x變體，其具有在選自根據(jù)SEQIDNO: 1的(X)x的S53 ; A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六個位置中的至少兩個、或S個、或四個、或五個或甚至 六個協(xié)同且因此不同的氨基酸置換，導致顯著減少的耗氧率和/或對于除氧外的某些電子 介質顯著增加的介質活性。
[004引因此，本發(fā)明的發(fā)明人已能夠提供(X)x變體，與GOx-WT和根據(jù)SEQIDNO: 1的G化-T30V;I94V相比較，其氧化酶活性顯著降低，同時與(X)x-WT和GOx-T30V;I94V相比 較，該酶的脫氨酶活性顯著增加。
[0044] 在運點上，進一步出乎意料和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是：當在如條目gg)下的材料與方 法部分中概述的ABTS測定中，與GOx-WT和G0X-T30V;I94V相比較時，在位置F414和V560 中的特異性氨基酸置換顯著降低本文提供的(X)x變體的耗氧率。用于所述置換的合適氨 基酸是所有剩余19種蛋白源氨基酸。特別地，合適的氨基酸是用于位置F414的Arg、Asn、 Asp、切S、Gly、His、Met、lie、Leu、Ser、1"虹、Tyr和Val，W及用于位置V560 的Ala、lie、 Leu、Met、Pro、Tyr、T虹和Val。
[0045] 作為另一個出乎意料和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：當與(X)x-T30V;I94V相比較時，除本文 提