專利名稱：改善肥胖癥的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種含有染料木黃酮、用于改善或治療肥胖癥的組合物，所述染料木黃酮能加速肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(Carnitine PalmitoylTransferase-1)(以下簡稱“CPT-1”)的表達。具體地說，本發(fā)明的組合物含有染料木黃酮和肉毒堿，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解關鍵酶CPT-1的表達，所述肉毒堿將脂肪酸轉運至線粒體中并加速脂肪酸氧化過程中的脂肪氧化。
背景技術：
肥胖癥是由能量攝入量和消耗量失衡引起的一種代謝紊亂狀態(tài)，由此產生的未被消耗的多余能量作為脂肪積累起來，導致體內脂肪異常增長。肥胖癥是東西方國家普遍存在的重要健康問題，據(jù)報道，大約30-40％的人有肥胖問題。肥胖引發(fā)應激反應，并且是高血壓、高血脂、動脈硬化、心臟病、糖尿病等類似疾病的重要誘因。
肥胖癥的誘因有很多，例如高脂肪和高熱量的食品、缺乏鍛煉、內分泌系統(tǒng)紊亂或者病理問題。另外，遺傳因素很重要，其重要性可從下列事實估量出來肥胖癥在與遺傳因素相關的某個家族中頻繁發(fā)生。據(jù)報道，遺傳因素對肥胖癥的影響至少占30-50％。
世界范圍內已經廣泛展開了對治療和預防肥胖癥的方法或療法的研究和調查?，F(xiàn)有的方法包括減少食物攝入量以減少能量的節(jié)食療法，增加能量消耗的鍛煉療法，諸如切除部分內臟器官或抽脂的外科手術療法，以及使用代謝增強劑、食欲抑制劑或消化/吸收抑制劑的藥物療法。但是令人滿意的方法仍未見報道，上述的方法存在副作用，例如溜溜球效應——停止治療之后，肥胖癥變得更加嚴重；節(jié)食療法引起營養(yǎng)不均衡；或者免疫力下降導致的感染。特別是藥物療法引起的抑郁、失眠、消化不良或其它類似現(xiàn)象。因此亟需發(fā)明一種安全、有效、無副作用的治療和預防肥胖癥的方法。
鑒于許多疾病都由肥胖癥引起，減少機體脂肪比簡單地降低體重更重要。因此，亟待尋求一種減少體內脂肪積累并加速脂肪氧化的方法。在此情況下，加速脂肪β氧化的方法成為治療肥胖癥的主要靶標。在這類方法中，控制CPT-1的表達可以實現(xiàn)加速脂肪酸的氧化。所述CPT-1是決定脂肪酸β氧化反應速度的酶。迄今為止，通過加速CPT-1的表達以增加脂肪氧化，從而達到抑制肥胖目的的方法尚未得到廣泛研究(McCarty，Medical Hypotheses57(3)324-336，2001)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人研究尋找加速CPT-1表達的天然物質，所述CPT-1酶為脂肪酸氧化反應的限速酶，結果發(fā)現(xiàn)一種大豆異黃酮——染料木黃酮能加速CPT-1的表達，并且口服無副作用，能減少肥胖，并最終完成本發(fā)明。
此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，將在脂肪酸往線粒體內轉運中起重要作用的L-肉毒堿加入到含有染料木黃酮的組合物中，能夠得到加速CPT-1表達的協(xié)同效應。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種治療肥胖癥的組合物，該組合物能夠加速CPT-1的表達而加速機體脂肪的氧化代謝，所述CPT-1為脂肪氧化的限速酶。
本發(fā)明提供了一種治療肥胖癥的組合物，該組合物含有染料木黃酮和L-肉毒堿，所述染料木黃酮是一種大豆異黃酮，能加速脂肪酸脂解關鍵酶肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)的表達，所述肉毒堿在將脂肪酸轉運至線粒體過程中起重要作用，并加速脂肪酸氧化。
下面詳細描述本發(fā)明。
肥胖癥起因于脂肪積累并與遺傳因素有關，脂肪積累是由攝入和消耗的營養(yǎng)能量不均衡以及新陳代謝紊亂所造成的，所述新陳代謝紊亂包括脂肪氧化酶的內分泌量低、脂肪氧化酶——瘦素(Leptin)分泌量低、腎上腺素受體問題。
脂肪酸是一種脂肪組分，在細胞內經過β氧化、三羧酸(TCA)循環(huán)和氧化磷酸化作用轉化為可被用做能量的形式，同時消耗大量氧氣并產生三磷酸腺苷(ATP)。但是脂肪酸分子大而不能穿過線粒體膜。從血液轉運至細胞液中的這些長鏈脂肪酸雖然不能直接通過線粒體膜，但是可以經過下列3步酶促反應而滲透到線粒體中1、在存在于線粒體外膜上的?；o酶A合成酶作用下，細胞液中的長鏈脂肪酸的羧基和輔酶A(Co-A)的巰基之間反應，形成硫羥酸酯。上述所形成的脂酰輔酶A具有和乙酰輔酶A一樣的高能化合物性質。
2、脂酰輔酶A酯不能通過線粒體內膜。為了將脂肪酸轉運至線粒體內部，存在于線粒體內膜外表而的CPT-1催化脂?；鶊F與Co-A中的肉毒堿發(fā)生酯交換反應。上述所形成的脂酰肉毒堿酯通過酰基肉毒堿/肉毒堿轉運載體，易化擴散到線粒體基質中。
3、脂酰肉毒堿在肉毒堿脂酰轉移酶II催化下形成脂酰輔酶A。
脂肪酸經過上述三步酶促反應轉移至線粒體基質中，并經β氧化轉化為乙酰輔酶A，最終經檸檬酸循環(huán)轉化為電子和CO2。上述電子通過呼吸鏈過程生成ATP(Lehninger等人，Principles of Biochemistry479-505，1993)。
本發(fā)明的染料木黃酮是加速CPT-1表達以促進脂肪氧化的主要成分，并由下列結構式1表示。
結構式1 染料木黃酮染料木黃酮是一種在大豆中含有的異黃酮，具有雙酚環(huán)作為化學主鏈。以糖苷形式存在的異黃酮被體內的葡糖苷酶轉化為糖苷配基形式如染料木黃酮或黃苷元(daidzein)。大豆異黃酮具有與雌激素相似的結構和功能，因此被報道為一種植物雌激素，而且大豆異黃酮還具有多種生理作用，如改善更年期紊亂(Albertazzi等人，Obstet Gynecol 91(1)6-11，1998，Anderson等人，Public Health Nutr 2(4)489-504，1999)、治療骨質增生(Scheiber等人，Menopause 6(3)233-241，1999)、降低膽固醇(Potter等人，Am J Clin Nutr 68(6suppl)1375S-1379S，1998)、抗癌作用(Messina等人，Nutr Cancer 21(2)113-131，1994)。尤其是有報道指出，染料木黃酮在細胞內抑制蛋白酪氨酸激酶的活性從而阻斷多種生長因子信號，并且抑制異構酶的活性從而直接抑制細胞的增殖(Murkies等人，J Clin Endocrinol Metab 83(2)297-303，1998)。異黃酮的抗氧化作用已經被多種體內或體外實驗所證實，例如，抑制脂肪氧化酶的活性，抑制過氧化氫或超氧陰離子的產生，以及增強諸如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性(Cai和Wei，Nutri Cancer 25(1)1-7，1996)。
以該組合物的總重量為基準，本發(fā)明的組合物含有0.001-30重量％的染料木黃酮。
此外，本發(fā)明治療肥胖癥的組合物可以含有與染料木黃酮作用相似的其它異黃酮，例如黃苷元或黃豆黃素(glycitein)。
肉毒堿是β-羥基-γ-三甲銨丁酸的通用名，在脂肪氧化中起作用，肉毒堿還在將具有10個以上碳原子的長鏈脂肪酸從線粒體外膜轉運至線粒體內基質的過程中起重要作用，并由下列結構式2表示。
結構式2 L-肉毒堿如上所述，L-肉毒堿是將脂肪氧化產生能量的一種重要成分，它在肝或腎中合成并在肉類中普遍存在。L-肉毒堿不足時，線粒體中的脂肪酸濃度變低，結果產生的能量也有所下降。另外還有報道指出，以L-肉毒堿為底物的CPT-1在脂肪酸氧化反應中起限速酶作用(Eaton，Prog Lipid Res 41(3)197-269，2002)。
以組合物的總重為基準，本發(fā)明的組合物含有0.001-50重量％的L-肉毒堿。
總之，本發(fā)明提供了一種治療肥胖癥的組合物，該組合物含有如結構式1所示的染料木黃酮和如結構式2所示的L-肉毒堿，該組合物可以加速脂肪細胞中脂肪的氧化，而且可以口服。
本發(fā)明的組合物還可以含有本領域常用的其它組分。所述組合物可以用作配制成如下形式的保健食品或藥品片劑、膠囊、軟膠囊、珠劑(beads)、顆粒劑、飲劑、條形食物(diet bars)、巧克力、飴糖、點心(snacks)等。


圖1顯示了染料木黃酮和L-肉毒堿對雄性SD大鼠脂肪細胞中脂肪的氧化作用；
圖2a為RNA印跡(northern blotting)測試法，顯示使用本發(fā)明的組合物加速肝中CPT-1的表達，A高脂肪飼料，B高脂肪飼料+L-肉毒堿(0.2％)，C高脂肪飼料+染料木黃酮(0.2％)，D高脂肪飼料+L-肉毒堿(0.2％)+染料木黃酮(0.2％)，E高脂肪飼料+染料木黃酮(0.4％)；圖2b為光密度分析圖，顯示使用本發(fā)明的組合物加速肝中CPT-1的表達，HFD高脂肪飼料，CAL-肉毒堿，GE染料木黃酮。
具體實施例方式
下面通過實驗實施例和配方實施例更加詳細地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍并不僅限于實施例。描述這些實驗實施例和配方實施例是為了解釋本發(fā)明，本領域技術人員清楚本發(fā)明的范圍不限于這些實施例。實驗實施例和配方實施例中數(shù)量單位是重量％。
參考實施例1將從雄性SD大鼠分離出的附睪脂肪組織切成小塊，并加入0.1％膠原酶(DMEM培養(yǎng)液中，未加酚紅)，在37℃培養(yǎng)2小時后，過濾得到脂肪細胞。
實驗實施例1雄性SD大鼠脂肪細胞內中性脂肪氧化的加速為了證實雄性SD大鼠脂肪細胞內中性脂肪氧化的加速，使用在參考實施例1中得到的脂肪細胞進行實驗。對照組在不含本發(fā)明組合物(實驗材料)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗實施例中，染料木黃酮和/或L-肉毒堿的加入量為10微摩爾單位。通過將對照組數(shù)據(jù)轉換成100％，相對地計算結果。通過測定從脂肪細胞析出到培養(yǎng)基中的丙三醇的濃度，可以確定脂肪的氧化程度。
通過向脂肪細胞中加入含有0.5％牛血清白蛋白(BAS)且不含脂肪酸的無色達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM(Dulceco’s modified eaglesmedium))，制備細胞培養(yǎng)物，使用該細胞培養(yǎng)物進行實驗。采用購自Sigma公司(美國密蘇里州圣路易St.Louis，MO，U.S.A)的GPO-trinder試劑盒用顏色反應方法測定丙三醇的量，使用酶聯(lián)免疫分析測讀儀(ELISA reader)測定540納米下的吸光值。
如圖1所示，與對照組相比，當單獨使用染料木黃酮和L-肉毒堿時，脂肪酸氧化量分別增長到1.92倍和2.07倍；當聯(lián)合使用染料木黃酮和L-肉毒堿時，脂肪酸氧化量增長到2.7倍。
實驗實施例2為了證實本發(fā)明的組合物對由飼喂高脂肪飼料引起的肥胖動物中的脂質代謝的作用，選擇白化雄性Sprague-Dawley大鼠模型。為了證實染料木黃酮、黃苷元和黃豆黃素對高脂肪飼料誘導的肥胖癥的作用，選擇6周齡的大鼠適應一周，每實驗組分配12只大鼠。實驗組如下(1)正常脂肪飼料；(2)高脂肪飼料；(3)高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮；(4)高脂肪飼料+0.2％L-肉毒堿；(5)高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒堿；(6)高脂肪飼料+0.2％黃苷元；(7)高脂肪飼料+0.2％黃苷元+0.2％L-肉毒堿；(8)高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素；(9)高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素+0.2％L-肉毒堿，并且上述各組大鼠連續(xù)飼喂8周?；緦嶒烇暳蠟榧兓腁IN-93G配方飼料，所制備的高脂肪飼料中脂肪占總能量的36％(脂肪占飼料總量的18％)，所制備的正常脂肪飼料中脂肪占總能量的17％(脂肪占飼料總量的7％)。
表1飼料的組成(克/千克飼料)


1)正常飼料AIN-93G配方飼料2)礦物質混合物AIN-93G配方礦物質混合物(克/千克混合物)3)維生素混合物AIN-93G配方維生素混合物(克/千克混合物)飼喂過程中，每周測量3次飼料消耗量和體重。飼喂過程結束之后，測量最終體重，體重變化如表2所示。
表2

如表2所示，大鼠體重在飼喂前互相之間不存在差別。然而，與高脂肪飼料對照組相比，飼喂染料木黃酮組的體重增加量小。此外，將染料木黃酮和L-肉毒堿一起飼喂的組的體重增加量更小。但是單純飼喂L-肉毒堿組與高脂肪飼料對照組的體重增加量幾乎相同。另外，與對照組比較，飼喂黃苷元和黃豆黃素代替染料木黃酮的兩組的體重增加量也小?？傊筛咧撅暳险T導出肥胖癥的大鼠，可通過飼喂染料木黃酮抑制大鼠體重增加；當聯(lián)合飼喂L-肉毒堿時，抑制體重增加的效果更加明顯。為了進行比較，各測試組消耗的飼料量幾乎相同。
實驗實施例39組大鼠分別用正常脂肪飼料、高脂肪飼料、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮、高脂肪飼料+0.2％L-肉毒堿、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒堿、高脂肪飼料+0.2％黃苷元、高脂肪飼料+0.2％黃苷元+0.2％L-肉毒堿、高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素、高脂肪飼料+0.2％黃豆黃素+0.2％L-肉毒堿飼喂8周后，處死大鼠并取其附睪脂肪組織。用生理鹽水洗滌上述得到的附睪脂肪，在濾床上除去水分，然后稱重。
表3

如上表所示，與高脂肪飼料對照組相比，飼喂染料木黃酮組的附睪脂肪組織的重量較小，聯(lián)合飼喂L-肉毒堿組的附睪脂肪組織重量更小?？傊加杏筛咧撅暳险T導的肥胖癥的大鼠，可通過飼喂染料木黃酮來抑制機體脂肪增加；當聯(lián)合飼喂L-肉毒堿時，抑制機體脂肪增加的效果更加明顯。但是，當只飼喂L-肉毒堿時，該組的附睪脂肪組織重量與高脂肪飼料對照組的幾乎相同。另外，飼喂黃苷元和黃豆黃素代替染料木黃酮的兩組與對照組比較，兩組的機體脂肪重量也較小。
實驗實施例4分別用下列4組高脂肪飼料、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮、高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒堿、高脂肪飼料+0.4％染料木黃酮飼喂8周后，處死大鼠取其肝組織。將肝組織勻漿后，用由苯酚利異硫氰酸胍組成的總RNA提取試劑盒(TRIZOL)(美國紐約grand Island生物技術公司)從該組織中提取RNA。使用RNA印跡(northern blotting)測試法測定上述提取出的RNA中的CPT-1 mRNA表達程度并用光密度分析法定量表示該表達程度，結果如圖2a和圖2b所示。
如圖2b所示，與高脂肪飼料組相比，飼喂染料木黃酮組的CPT-1表達增加，并且當聯(lián)合飼喂L-肉毒堿時，這種增加更為明顯。此外，高脂肪飼料+0.2％染料木黃酮+0.2％L-肉毒堿組[HFD+CA(0.2％)+GE(0.2％)]與高脂肪飼料+0.4％染料木黃酮組[HFD+GE(0.4％)]的CPT-1表達量相似。上述結果證實CPT-1表達量隨染料木黃酮的濃度增加而增加；當聯(lián)合飼喂L-肉毒堿時得到協(xié)同效應。所述協(xié)同效應可以防止使用過量染料木黃酮所帶來的副作用，例如雌性大鼠內分泌紊亂、雄性大鼠精子和精液減少(Kazushi Okazaki等，ArchToxicol 2002，76553-559；K.Barry Delclos等，Reproductive toxicology 2001，15647-663)。此外，由于染料木黃酮是非常昂貴的材料，利用協(xié)同效應可以減少其用量，從而節(jié)約成本。
配方實施例1軟膠囊將80毫克染料木黃酮、180毫克大豆油、2毫克棕櫚油、8毫克植物油、4毫克蜂蠟和6毫克卵磷脂混合，按照常規(guī)方法往每個膠囊中填裝400毫克混合物，制成軟膠囊。
配方實施例2片劑將74毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒堿、200毫克低聚半乳糖、60毫克乳糖和140毫克麥芽糖混合，用流化床干燥器造粒，再向其中加入6毫克糖酯，擠壓制得片劑。最終得到片劑600毫克。
配方實施例3顆粒劑將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒堿、250毫克結晶葡萄糖酸酐、550毫克淀粉混合，使用流化床造粒機造粒，包裝。最終得到顆粒劑1克。
配方實施例4飲劑將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒堿、10克葡萄糖、0.6克檸檬酸和25克液態(tài)寡糖混合，再向其中加入300毫升純凈水，分別灌裝到200毫升的瓶中。灌裝后，130℃下滅菌4-5秒即得到最終飲劑。
配方實施例5飴糖將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒堿、1.8克玉米糖漿、0.5克脫脂奶粉、0.5克大豆卵磷脂、0.6克黃油、0.4克植物油、1.4克糖、0.58克人造黃油和20毫克食鹽混合，加工成形得到飴糖。最后得到飴糖6克。
配方實施例6條形食物將80毫克染料木黃酮、120毫克L-肉毒堿、20克淀粉、9克小麥粉、11克淀粉糖漿、11.6克麥芽糖、6克人造黃油、30毫克食鹽、30毫克檸檬酸、140毫克碳酸鈉和2克糖酯混合，加工成條形。最終得到條形食物60克。
如上所述，本發(fā)明用于節(jié)食、預防或治療肥胖癥的組合物可以防止并控制肥胖。該組合物含有染料木黃酮和L-肉毒堿，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解代謝途徑的關鍵酶肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)的表達。所述L-肉毒堿將脂肪酸轉運到線粒體中，并加速脂肪氧化。
權利要求
1.一種治療肥胖癥的組合物，該組合物含有至少一種加速肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)表達的組分。
2.根據(jù)權利要求1所述的治療肥胖癥的組合物，該組合物加速脂肪細胞內中性脂肪的氧化(脂解)。
3.根據(jù)權利要求1所述的治療肥胖癥的組合物，其中，所述加速肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(CPT-1)表達的組分為染料木黃酮和L-肉毒堿。
4.根據(jù)權利要求3所述的治療肥胖癥的組合物，其中，以該組合物的總重量為基準，染料木黃酮的含量為0.001-30重量％，L-肉毒堿的含量為0.001-50重量％。
5.根據(jù)權利要求3所述的治療肥胖癥的組合物，該組合物含有黃苷元或黃豆黃素以替代染料木黃酮。
6.根據(jù)權利要求1所述的治療肥胖癥的組合物，該組合物具有選自由片劑、膠囊、軟膠囊、珠劑、顆粒劑、飲劑、條形食物、巧克力、飴糖和點心所組成的組中的配方。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種含有染料木黃酮、用于改善或治療肥胖癥的組合物，所述染料木黃酮能加速肉毒堿棕櫚酰轉移酶1(CPT－1)的表達。具體地說，本發(fā)明的組合物含有染料木黃酮和肉毒堿，所述染料木黃酮加速脂肪酸脂解關鍵酶CPT－1的表達，所述肉毒堿將脂肪酸轉運至線粒體中并加速脂肪酸氧化過程中的脂肪氧化。
文檔編號A61P3/00GK1758906SQ200380110196
公開日2006年4月12日 申請日期2003年10月21日 優(yōu)先權日2003年3月25日
發(fā)明者樸賢宇, 金宣姈, 金完起, 金修晶, 金俞, 金知賢, 李泰龍, 沈榮哲, 李尚駿 申請人:株式會社太平洋