一種提高多種酶制劑產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種酶制劑的生產(chǎn)方法，特別涉及一種提高多種酶制劑產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶制劑工業(yè)在國民經(jīng)濟中占據(jù)了重要作用，其應(yīng)用領(lǐng)域遍及輕工、食品、化工、醫(yī) 藥、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)以及能源、環(huán)境保護等，產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟效益。目前，酶制劑應(yīng)用領(lǐng)域 不斷擴大，生產(chǎn)技術(shù)水平不斷提高，然而與國外先進水平相比尚有差距。目前利用微生物發(fā) 酵法生產(chǎn)酶制劑的不足之處是在于酶分泌效率不高，導致發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本較高。
[0003] 大多數(shù)工業(yè)酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)主要是利用好氧菌進行有氧發(fā)酵，無論是種子培養(yǎng) 還是大罐發(fā)酵都需要進行通風供氧。由于菌株好氧發(fā)酵過程中需氧量大，特別是發(fā)酵中后 期，短時間內(nèi)需氧量很高，而此時由于菌體及代謝產(chǎn)物不斷增多導致發(fā)酵液粘稠，細胞膜通 透性降低，不利于氧氣的傳遞，常規(guī)的依靠增大通風量或不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速等方式來提高 溶氧有時也不能滿足需要。無論是通風量亦或是攪拌轉(zhuǎn)速都有上限，不能無限提高，況且開 啟程度越大，發(fā)酵設(shè)備的損壞度以及能耗也越大，使得維修費用和成本增加。另外，通氣量 過高或轉(zhuǎn)速過快，也容易對細胞造成機械損傷。
[0004] 當前，大多數(shù)工業(yè)酶制劑為胞外酶，生產(chǎn)過程為在胞內(nèi)產(chǎn)生后通過細胞膜分泌到 細胞外。隨著發(fā)酵的進行，尤其是中后期，發(fā)酵液粘稠度增大，細胞內(nèi)外滲透壓增大，細胞通 透性降低，而此時胞內(nèi)酶也處于大量產(chǎn)生階段，若胞內(nèi)的酶向外分泌不及時，會引發(fā)由于胞 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物濃度過高而導致的反饋性抑制，使酶的合成量減少，產(chǎn)量降低。
[0005] 為了提高酶制劑的產(chǎn)量，國內(nèi)外的本領(lǐng)域技術(shù)人員進行了大量的研究工作，并提 供了一系列的方法。
[0006] 比如：中國專利申請CNN101851614公開了一種提高酶制劑產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，該工 藝方法在生產(chǎn)過程中通入高含氧量的壓縮空氣，以達到增加酶制劑產(chǎn)量的目的。但上述方 法需要氧氣發(fā)生器，工藝復雜，成本較高。
[0007] 日本專利JPS55148090公開了通過外加磁場的方法提高酶制劑產(chǎn)量的方法，該方 法需要額外的磁力發(fā)生器，同樣工藝復雜，成本較高。
[0008] 日本專利JPS527481公開了一種提高酶制劑產(chǎn)量的方法，該方法采用有機溶劑為 助劑，雖然在一定程度提高了酶制劑的產(chǎn)量，但是加入的有機溶劑對酶活性及后續(xù)的分離 步驟帶來了不利的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于一種提高多種酶制劑產(chǎn)量且經(jīng)濟方便的 方法。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的提高多種酶制劑產(chǎn)量的方法為發(fā)酵生產(chǎn)，其中 的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽，其特征在于還包括通式（1)化合物中的一種或者 兩種以上；
[0011]
[0012] R代表(^~（]2。烷基。
[0013] 優(yōu)選的通式（1)化合物R為Cl~C12烷基。優(yōu)選的化合物為甜菜堿、月桂基甜菜 堿（N-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸）、辛基甜菜堿（N-辛基-N，N-二甲基甘氨酸）、異丙 基甜菜堿（N-異丙基-N，N-二甲基甘氨酸）。
[0014] 通式（1)化合物在培養(yǎng)基中所起的作用，可能具有以下機理：
[0015] 1、作為高效甲基供體，參與甲基化反應(yīng)以及能提高代謝途徑中關(guān)鍵酶的酶活，來 加快菌體生長速率及代謝物產(chǎn)量。
[0016] 2、能提高細胞膜通透性，促進營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣在胞內(nèi)外的交換，以及提高微生物 的呼吸鏈系統(tǒng)，顯著提高菌體的呼吸特性。
[0017] 3、作為滲透壓保護劑，能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓，更有利于胞內(nèi)產(chǎn)物向胞外的釋 放，解決由胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物濃度過高導致的反饋性抑制問題。降低高滲透壓導致的呼吸抑制， 加快氧氣在細胞內(nèi)外的傳遞速率，降低能耗。
[0018] 4、作為表面活性劑具有乳化劑的作用，更加快了氧氣在粘稠的發(fā)酵液中的傳遞速 度。
[0019] 最優(yōu)的通式（1)化合物R為甲基，即為甜菜堿，可以選自無水甜菜堿、一水甜菜堿、 鹽酸鹽甜菜堿、磷酸甜菜堿中的一種或者兩種以上。
[0020] 甜菜堿，又名N，N，N_三甲基甘氨酸，是一種季銨型水溶性生物堿。因最初從甜菜 中提取而得名甜菜堿，純品為白色片狀結(jié)晶，有甜味，易吸潮，可速溶于水，易被消化吸收， 使用安全，無毒副作用。除了上述可能的作用機理外，甜菜堿對提高種子液中菌球的分散度 和菌體量也有明顯的良性效果。
[0021] 通式（1)化合物在酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度0? 015~7.Og/dl，優(yōu)選為0? 05~ 0? 5g/dl〇
[0022] 本發(fā)明方法適用的酶制劑包括：纖維素酶、木聚糖酶、糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、月旨 肪酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶、a-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶等。
[0023] 本發(fā)明方法適用于以下各種酶制劑的發(fā)酵菌：
[0024] 細菌類：
[0025] 大腸桿菌，（枯草、地衣、解淀粉、短小、多粘類）芽胞桿菌等。
[0026] 真菌類：
[0027] 1.酵母類：（畢赤、假絲）酵母等；
[0028] 2.霉菌類：（里氏、長柄）木霉，（米、黑）曲霉，（繩狀、特異）青霉等。
[0029] 根據(jù)底物的不同，發(fā)酵條件也有所改變。發(fā)酵在有氧條件下進行，需要攪拌或振 蕩。
[0030] 本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加通式（1)化合物來提高酶制 劑產(chǎn)量，解決問題一：由于發(fā)酵過程供氧不足及氧傳遞減弱導致的菌體呼吸抑制；解決問 題二：解決胞內(nèi)產(chǎn)物（酶制劑）向胞外的分泌出現(xiàn)不暢或不及時，而引起的胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物濃 度過高導致的反饋性抑制問題。從而提高酶合成效率，最終提高酶制劑產(chǎn)率并降低能耗。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 實施例1
[0033] 種子培養(yǎng)基（g/dl):玉米漿3,葡萄糖3,微晶纖維0. 6,MgS04 ? 7H20 0. 05， KH2P040 . 3,（_2S040 . 2,NaN030. 15,尿素 0? 1，pH調(diào)至 5. 0,在 115。。下，加熱 15 分鐘進行 滅菌。
[0034] 將里氏木霉CICC40358接種于5L種子罐中，在30°C下，振蕩培養(yǎng)40h。
[0035] 纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/dl)為：麩皮3,玉米秸桿粉3,微晶纖維0.6， MgS04 *7H20 0. 05，KH2P040 . 3,（NH4)2S040 . 2，NaN030. 15,尿素 0. 1，培養(yǎng)基中分別添加下表所 示濃度的的月桂基甜菜堿，調(diào)整pH至5. 0。將3L培養(yǎng)基放入5L的全自動發(fā)酵罐，在121°C 下，加熱20分鐘進行滅菌。
[0036] 在每個發(fā)酵罐中接入300ml按上述培養(yǎng)得到的種子，通空氣培養(yǎng)，溫度為30°C。在 培養(yǎng)過程中，采用液堿和磷酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其維持在4. 0-5. 5,發(fā)酵培養(yǎng)100小時結(jié) 束。纖維素酶活測定采用濾紙酶（FPA)活測定。酶活定義：以lml酶液lmin分解底物生成 1ymol葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位。結(jié)果見下表：
[0037]表1.
[0038]
[0039]
[0040] 實施例2
[0041] 種子培養(yǎng)基（g/dl):玉米粉5,玉米漿5,豆餅粉3,pH4. 5,在115°C下，加熱20分 鐘進行滅菌。
[0042] 將黑曲霉菌CICC2108接種于裝液量3L的5L種子罐中，在30°C下，培養(yǎng)42h。
[0043] 糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/dl)為：玉米粉14,玉米漿6,豆餅粉5,（NH4) 2S040 . 2。培養(yǎng) 基中分別添加下表所示濃度的辛基甜菜堿，調(diào)整pH至4. 5。將3L培養(yǎng)基放入5L的全自動 發(fā)酵罐，在115°C下，加熱20分鐘進行滅菌。
[0044] 在每個發(fā)酵罐中接入300ml按上述培養(yǎng)得到的種子，通空氣培養(yǎng)，溫度為30°C。在 培養(yǎng)過程中，采用液氨調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其維持在4. 4-4. 6。發(fā)酵培養(yǎng)160小時后，發(fā)酵 完畢。測定培養(yǎng)基中的糖化酶酶活。在40°C、pH4. 6的條件下，lml液體酶（lg固體酶粉） 每小時降解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖，即為1個酶活力單位，U/ml(U/g)。次碘酸鹽容量 法測定糖化酶酶活。結(jié)果見下表：
[0045]表 2.
[0046]
[0047] 實施例3
[0048] 種子培養(yǎng)基（g/dl):葡萄糖3,玉米漿3,酵母粉0. 5,NaCL1.5,K2HP040. 1， MgS04 ? 7H20 0? 0