花萼、花瓣、花藥以及雌蕊的cDNA。
[0046] 實施例2 基因的合成及測序 利用RNA-Seq方法對辣椒可育株和不育株的八個等級混合花蕾進(jìn)行RNA表達(dá)差異分 析，發(fā)現(xiàn)一個983bp的EST序列只在可育株中表達(dá)，以該序列為探針在NCBI中比對分析表 明，該EST與許多雄性不育相關(guān)蛋白2(male sterility 2)有較高的相似性(約75%)，這些 male sterility 2在花粉發(fā)育過程中起著重要的作用，推測該基因可能與花粉發(fā)育相關(guān)。 將該基因通過電子克隆、3' RACE和5' RACE擴(kuò)增，得到cDNA拼接序列全長，命名為Ca#57， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0047] 為了驗證推測，設(shè)計了一對特異引物： 上游（5, -3'）：CTATAATCTTTCCTTCCAITCCCTITG 下游（5' -3'）：AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA 以可育株辣椒八個等級混合混合花蕾的cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行特異PCR。擴(kuò) 增的反應(yīng)體系為：cDNA 模板 1 yL，10XcDNA PCRbuffer 2.5 yL，dNTP Mix (2.5 mmol/ L)2 yL，上游引物 1 yL，下游引物（10 ymol/L)L0 yL，ra濟(jì)每 0.25 yL，ddH20 17.25 y L，總體積25. 0 y L。PCR擴(kuò)增程序為：94°C預(yù)變性3 min ;94°C變性50 s，50~54°C退火 40 s，72°C延伸2 min，35個循環(huán)后再72°C延伸5 min?；厥誔CR產(chǎn)物，并克隆測序。
[0048] 上述PCR得到了一條約2000bp的條帶，回收該條帶，并克隆測序，得到了 的 cDNA序列全長1919bp，包含一個1758bp的最大開放閱讀框，如圖2所示，其編碼的氨基酸 序列如SEQ ID N0:2所示。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)該序列正確，并驗證了拼接結(jié)果。
[0049] 實施例3 RT-PCR和qRT-PCR分析基因的時空表達(dá)特性 RT-PCR 分析： 分別以實施例1獲得的不育株和可育株8個等級花蕾以及根、莖、葉、開放花、花萼、花 瓣、花藥以及雌蕊一鏈cDNA為模板，以Jdii?為內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR分析，檢測各花粉 發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況。
[0050] CaMS 1基因特異引物： 上游：5' -AAATCTTCCCTCAGGAGTCAATCAG-3' ； 下游：5，-AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA-3， 以及寺異引物： 上游：5' -CCTCTTCACTCTCTGCTCTCTCCTCA-3' ； 下游：5' -GTCATTTTCTCTCTATTTGCCTTGGG-3' RT-PCR的反應(yīng)體系為：cDNA模板1. 0 y L，10XPCR buffer2. 0 y L，上下游特異引物 (10yM)各 0.6 yL，dNTPs (2.5mM) 1.6 DNA polymerase (5 U/yL)0.2 yL， 補(bǔ)足ddH20至20 yL。RT-PCR所用程序為：94°C預(yù)變性3 min;94°C變性30 s，50~55°C退 火30 s，72°C延伸60 s，26~30個循環(huán)后再72°C延伸5 min，10°C下保存。PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照。
[0051] 以如故為內(nèi)參基因，用基因特異引物對進(jìn)行了花蕾發(fā)育不同時期 和不同組織部位的RT-PCR表達(dá)分析，結(jié)果表明，^#57在花蕾的不同發(fā)育時期有不同的表 達(dá)水平。在可育株的第1~4級花蕾中幾乎見不到該基因的表達(dá)。在第5級花蕾時突然表達(dá) 強(qiáng)烈，而在第6級花蕾及其以后等級的花蕾檢測不到其表達(dá)情況。在不育株的各級花蕾中 均檢測不到它的表達(dá)（圖3a)。這說明在辣椒花蕾發(fā)育的中期表達(dá)，推測可能 參與了絨氈層的發(fā)育。另外，在對不同器官的表達(dá)情況進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，^#57僅在可育株 的花藥中表達(dá)，而在其它部位，如根、莖、葉、花萼、花瓣、雌蕊均不表達(dá)。在不育株中的所有 的檢測的部位該基因都不表達(dá)（圖4a)，也說明該基因可能與花藥發(fā)育有關(guān)。
[0052]分析： 為了進(jìn)一步驗證RT-PCR的結(jié)果，本研究對該基因進(jìn)行了 qRT-PCR分析。首先以辣椒各 級花蕾的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，然后再以辣椒的根、莖、葉、開放花、花萼、花瓣、花藥、 雌蕊的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。
[0053] CaMS 1基因特異引物： 上游：5' -ATGATGGCGAAAGAGGTTGACG-3' ； 下游：5' -CCATTTACATACGCTGTGGATACTTG-3' 以及寺異引物： 上游：5' -AATCAATCCCTCCACCTCTTCACTC-3' ； 下游：5' -CATCACCAGCAAATCCAGCCTT-3' qRT-PCR 反應(yīng)體系如下：cDNA 模板 1.0 yL、10 yL 2XSYBR GreenI MIX、15 ymol L1正向引物0.2 yL、15 y mol L 1反向引物0.2 yL，加水至總體積達(dá)到20 yL。PCR程 序：94°C 2 min;94°C 10 s，56°C 20 s，72°C 35 s，40個循環(huán)；產(chǎn)物用融解曲線分析，并用 瓊脂糖凝膠電泳驗證。BI0-RAD公司的IQ5軟件收集數(shù)據(jù)。各基因在不同材料之間的相對 表達(dá)量用CT值的2 △△ CT法處理獲得（Livak et al，2001)。
[0054] 結(jié)果表明，在可育株中，的表達(dá)首先在第4級的花蕾中檢測到微弱的表達(dá)， 在第5級表達(dá)量達(dá)到最大值，而在第6級花蕾中也僅有微弱的表達(dá)。在可育系的第7、8等 級，以及不育株的第1~8等級均檢測不到該基因的表達(dá)（圖3b)。這一結(jié)果與前面的RT-PCR 結(jié)果類似，驗證了前面的結(jié)果。在對仏#57在不同器官中的表達(dá)情況進(jìn)行分析時，qRT-PCR 同樣驗證了前面RT-PCR的結(jié)果（圖4b)，即G#57只在可育株的花藥中表達(dá)，是一個花藥特 異的基因。
[0055]實施例4構(gòu)建基因的RNAi干擾載體 1. 基因RNAi正、反義片段的克隆 根據(jù)實施例2中^#57基因全長的測序結(jié)果，通過Blast比對，分別選取基因中間一段 含有內(nèi)含子的序列設(shè)計2對特異引物，在正義片段的兩端引入Sral和Afcol限制性內(nèi)切酶 切位點，在反義片段的兩端引入和ifefl限制性內(nèi)切酶切位點，以辣椒八個等級混合 混合花蕾cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出正義、反義基因片段，其目的片段大小約為200bp。
[0056] 正、反義序列的引物是： UP-SP4-1 :5, -CGGATTTAAATAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3,， UP-SP4-2：5' -CGCGGATCCAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3'； DW-SP4-1：5'-CATGCCATGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3r， DW-SP4-2 ：5r -TCCCCCGGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3'。
[0057] (1)擴(kuò)增體系：
(2)反應(yīng)條件 94。(：，5 minWfCaminjrai min，72°C，2 min，30個循環(huán)；72。(：，10 min;16°C保存。
[0058] PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收。取20 y L PCR回收產(chǎn)物送測序公司測序。
[0059] 上述目的片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出大小約210bp的正、反義片段（圖5)，連接 到 PMD19-T載體上，測序結(jié)果分別是為215bp、212 bp (圖6,圖7)，經(jīng)Blast分析表明擴(kuò)增 片段正確（圖8)。
[0060] 2?正義片段的插入 (1) PFGC5941空質(zhì)粒和正義片段的雙酶切 采用堿裂解法提取大腸桿菌中的PFGC5941空質(zhì)粒，然后分別都用和Afcol雙酶切 PFGC5941空質(zhì)粒和回收得到的正義片段，37°C酶切過夜。雙酶切體系如下：10Xbuffer(K) 41^，85厶41^，質(zhì)粒0嫩10 1^，5￥&111^，叱〇111^，加(1(11120至40 1^，混勻。
[0061] (2)pFGC5941空質(zhì)粒和正義片段的連接 先取雙酶切產(chǎn)物回收大片段和正義片段，然后用Takara的T4DNA連接酶16°C連接過 夜。連接反應(yīng)體系如下：T4 buffer 2. 5 yL，正義片段10 yL，質(zhì)粒載體2 yL，T4 DNA連 接酶1 y L，加ddH20至25 y L，混勻。 (3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 制備Z%5a感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Z%5a感受態(tài)，Km 100mg/L LB平板37°C培養(yǎng) 過夜。第二天挑取單菌落用含Km 100 mg/L LB液體37°C搖菌過夜，菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用 Afcol和雙酶切檢測。插入正義片段的載體命名為pFGC5941-A。
[0062] 3?反義片段的插入 (1) PFGC5941-A質(zhì)粒和反義片段的雙酶切 用堿裂解法提取大腸桿菌中的PFGC5941-A質(zhì)粒，然后分別都用及mHI和雙酶 切PFGC5941-A質(zhì)粒和回收的反義片段，30°C酶切過夜。雙酶切體系如下：10Xbuffer (T) 2 1^，85厶41^，質(zhì)粒0嫩10 1^，你遍111^，15財111^，加(1(11120至40 1^，混勻。
[0063] (2) pFGC5941-A質(zhì)粒和反義片段的連接 先取雙酶切產(chǎn)物回收大片段和反義片段，然后用Takara的T4DNA連接酶16°C連接過 夜。連接反應(yīng)體系同前述PFGC5941空質(zhì)粒和正義片段的連接反應(yīng)體系。
[0064] ( 3 )連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 PFGC5941-A質(zhì)粒和反義片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及質(zhì)粒的提取參照前述連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法。同一質(zhì)粒分別用及mHI、和Afcol兩套雙酶切檢測， 結(jié)果切出預(yù)期大小為200bp的目的條帶（圖9)，說明目的基因已成功插入到植物表達(dá)載體 PFGC5941 中，將其命名為 pFGC5941-B。
[0065] 4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 (1)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 1) 取新鮮制備的或_70°C保存的200 y L農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置冰上，完全解凍后輕輕 將細(xì)胞懸??； 2) 加入5 y L pFGC5941-B質(zhì)?；靹蚝蟊戏胖?0 min ; 3) 將離心管放入液氮中速凍5 min，37°C水浴中熱激1 min，迅速將轉(zhuǎn)至冰上，冰浴2 min ； 4) 加入1 mL YEP液體培養(yǎng)基，28 °C振蕩培養(yǎng)1 h