甘藍(lán)型油菜BnCP13基因在制備植物雄性不育系應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蕓薹屬如擬南芥及甘藍(lán)型油菜的分子 育種領(lǐng)域，具體涉及甘藍(lán)型油菜BnCP13基因在制備植物雄性不育系中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在有性繁殖的過程中不能正常產(chǎn)生花粉的遺傳現(xiàn)象稱為雄性不育。在被子植 物中，花藥是產(chǎn)生花粉并進(jìn)行有性生殖的重要器官。當(dāng)花藥形態(tài)發(fā)生完成后，小孢子母細(xì)胞 位于每個(gè)花粉囊的中心，周圍被四層體細(xì)胞包圍，由外到內(nèi)依次是：表皮層，內(nèi)層，中層和絨 氈層（Ma，2005;Sandersetal.，1999)。絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層的特殊體細(xì)胞，與小孢 子母細(xì)胞以及花藥發(fā)育后期的小孢子直接相互作用，在花粉發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的 作用。
[0003]油菜屬于十字花科，是僅次于大豆的第二大油料作物。油菜雜種優(yōu)勢(shì)比較明顯，雄 性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑。目前，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的雄性不育材料，在 理論和應(yīng)用方面取得了重要的進(jìn)展，而新型不育源的發(fā)現(xiàn)和研究一直是雜種優(yōu)勢(shì)研究的基 礎(chǔ)，并以此創(chuàng)造出更多的天然和人工不育材料，為油菜育種和生產(chǎn)所廣泛應(yīng)用。
[0004] 申請(qǐng)人將SEQIDNO. 1所示序列（BnCP13基因）通過轉(zhuǎn)基因方式轉(zhuǎn)入油菜或擬南 芥匯總，發(fā)現(xiàn)其可以導(dǎo)致擬南芥或油菜花藥發(fā)育異常，獲得雄性不育植株。因此BnCP13基 因在控制油菜或擬南芥花粉的育性，創(chuàng)造雄性不育轉(zhuǎn)基因新材料中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種分離的基因BnCP13在制備植物雄性不育系中的應(yīng) 用。特別是在蕓薹屬雄性不育系中的應(yīng)用，所述的基因BnCP13,其序列為SEQIDNO. 1所 示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQIDNO. 2所示。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0007] -種分離的基因BnCP13在制備植物雄性不育系中的應(yīng)用，包括利用基因工程的 技術(shù)，將BnCP13基因轉(zhuǎn)入目的植株中，可獲得雄性不育的目的植株T0代，通過連續(xù)雜交的 方法獲得能夠穩(wěn)定遺傳的植物不育系。所述的植物優(yōu)選蕓薹屬植株，特別優(yōu)選擬南芥和甘 藍(lán)型油菜。
[0008] 本發(fā)明所述的基因在制備雄性不育系時(shí)，優(yōu)選在構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其 轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加一種花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子，構(gòu)建含有BnCP13基因的重組表達(dá)載體， 為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選，對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，加入可在植物中表達(dá)的 編碼可產(chǎn)生顏色變化的⑶S基因和具有抗性的抗生素標(biāo)記物如卡那霉素和潮霉素。
[0009] 本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在植物中進(jìn)行表達(dá)的任 何載體，例如適用于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，如：PbllOl、PCAMBIA2300、 PMDC83等。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施案例中，所述的表達(dá)載體優(yōu)選的空載體是pMDC83(Liet al. , 2015) 〇
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0011] 利用本發(fā)明提供的基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜獲得的甘藍(lán)型油菜不育株，在其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) 時(shí)期與正?？捎隂]有明顯的差異，而在生殖生長(zhǎng)階段，花藥退化，無花粉產(chǎn)生，可以利用 其這一特性培育新的雄性不育材料，該遺傳資源在油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十 分重要的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實(shí)施例1中基因BnCP13在甘藍(lán)型油菜材料7365A和7365B中的差異化表 達(dá)。
[0013] 其中：7365A和7365B分別代表甘藍(lán)型油菜隱形核不育兩型系中的不育系和可育 系?！?mm表不花蕾直徑小于1mm 表不花蕾直徑為l_2mm ;2_3mm表不花蕾直徑為 2_3mm ;3_4mm表示花蕾直徑為3_4mm。
[0014] 圖2為構(gòu)建的BnCP13基因功能驗(yàn)證的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015] 圖2中的（A)圖為空載體pMDC83的圖譜；
[0016] 圖2中的（B)圖表示本發(fā)明構(gòu)建的植物表達(dá)載體pMDC83-BnCP13的圖譜；
[0017] A9pro :A9啟動(dòng)子；RB和LB:T-DNA的右側(cè)和左側(cè)邊界；mgfp6 :綠色熒光蛋白； HindIII、PstI、KpnI:限制性內(nèi)切酶；nos T:終止子；hgyromycin resistance:潮霉素抗性 基因；Kanamycin resistance:卡那霉素抗性基因。
[0018] 圖3為BnCP13基因轉(zhuǎn)擬南芥所得的轉(zhuǎn)化植株的形態(tài)學(xué)觀察及花粉的掃描電鏡觀 察圖。
[0019] 圖3中的A圖：表示野生型擬南芥（非轉(zhuǎn)基因）植株結(jié)角果的一個(gè)側(cè)枝；
[0020] 圖3中的B圖：表不擬南芥轉(zhuǎn)化植株結(jié)角果的一個(gè)側(cè)枝；
[0021] 圖3中的C圖：表示野生型擬南芥花的形態(tài)；
[0022] 圖3中的D圖：表示擬南芥轉(zhuǎn)化植株的花的形態(tài)；
[0023] 圖3中的E圖：表示野生型擬南芥植株雄蕊的亞歷山大染色；
[0024] 圖3中的F圖：表示擬南芥轉(zhuǎn)化植株雄蕊的亞歷山大染色；
[0025] 圖3中的G圖和I圖：表示野生型擬南芥植株花粉的外壁結(jié)構(gòu)；
[0026] 圖3中的H圖和J圖：表示擬南芥轉(zhuǎn)化植株的花粉的外壁結(jié)構(gòu)。
[0027]圖4為BnCP13基因轉(zhuǎn)擬南芥的轉(zhuǎn)化不育植株半薄切片觀察結(jié)果圖。
[0028] 圖4中的A，B，C，D圖分別表示擬南芥正常花藥發(fā)育的第七期、第八期、第十期和第 十二期；
[0029]圖4中的E，F(xiàn)，G，H圖分別表示轉(zhuǎn)化所得不育植株的花藥發(fā)育的第七期、第八期、第 十期和第十二期。
[0030] 圖5為BnCP13基因轉(zhuǎn)擬南芥的轉(zhuǎn)化不育植株的絨粘層細(xì)胞程序性死亡（P⑶）熒 光檢測(cè)結(jié)果圖；
[0031] 圖5中的A圖和B圖表示野生型擬南芥植株的花藥發(fā)育的第九期和第十期熒光檢 測(cè)圖；
[0032]圖5中的C圖和D圖表示轉(zhuǎn)化所得不育植株的花藥發(fā)育的第九期和第十期熒光檢 測(cè)圖。其中：熒光信號(hào)有兩種，紅色熒光是背景信號(hào)；黃色和綠色熒光是DNA片段化陽(yáng)性信 號(hào)。
[0033]圖6為BnCP13基因轉(zhuǎn)擬南芥的轉(zhuǎn)化不育植株的超薄切片顯微解剖結(jié)構(gòu)；
[0034] 圖6中的A圖表示正常的成熟花粉粒形成期；
[0035]圖6中的B圖表示正常的成熟花粉粒具有的花粉外壁結(jié)構(gòu)；
[0036] 圖6中的C圖和D圖表示轉(zhuǎn)化的不育植株在花藥發(fā)育后期花粉粒降解而且沒有花 粉外壁的形成。
[0037] 圖7為BnCP13基因轉(zhuǎn)甘藍(lán)型油菜品系'Westar'所得的不育植株的花及花藥染色 后的顯微照片圖。
[0038] 圖7中的A圖和B圖表示野生型（非轉(zhuǎn)基因）甘藍(lán)型油菜正?；ǖ男螒B(tài)圖；
[0039] 圖7中C圖表示野生型（非轉(zhuǎn)基因）甘藍(lán)型油菜正?；ǚ哿５拇姿嵫蠹t染色圖；
[0040] 圖7中的D圖和E圖表示轉(zhuǎn)化的甘藍(lán)型油菜不育植株的花的形態(tài)圖；
[0041] 圖7中F圖表示轉(zhuǎn)化的甘藍(lán)型油菜不育植株的花粉粒的醋酸洋紅染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步定義本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 常按照常規(guī)條件如工具書《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》（NewYork:ColdSpringHarbor Laboratory, 1989)中所述的條件，或者按照生產(chǎn)商提供的操作手冊(cè)中建議的方法。
[0043] 實(shí)施例1:
[0044] 甘藍(lán)型油菜中基因BnCP13的確定
[0045] 本實(shí)施例所用的材料為甘藍(lán)型油菜隱性核不育兩型系7365AB(Huanget al.，2007)，主要是由不育株7365A與可育株7365B進(jìn)行雜交，得到的F1代再與可育株 7365B回交，后代經(jīng)過多代近交構(gòu)建的近等基因系7365AB為不育兩型系。形態(tài)學(xué)觀察 表明，在開花期，在甘藍(lán)型油菜隱性核不育系7365A中，其花絲明顯的比可育材料要短，花 藥干癟，呈淡黃透明色，而可育材料花藥表面飽滿呈金黃色；申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜基因 BnCP13在不育系7365A與可育系7365B中存在差異性表達(dá)，該基因的特異表達(dá)可引起花藥 敗育，其表型類似于不育材料7365A。
[0046] 另一種材料為加拿大甘藍(lán)型春油菜Westar，為本領(lǐng)域的常規(guī)材料，該遺傳資源由 加拿大PlantBiotechnologyInstituteSaskatoon提供。本發(fā)明中使用的擬南芥轉(zhuǎn)化的 受體材料為Columbia生態(tài)型，購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中心ABRC。
[0047] 本發(fā)明中的BnCP13基因的CDS序列（見序列表SEQID N0:1所示中的l-1032bp 所示的序列）含有完整的0RF閱讀框及起始密碼子ATG，共編碼343個(gè)氨基酸（見序列表 SEQID N0 :2 所示）。
[0048] 1. 3BnCP13基因CDS序列的擴(kuò)增
[0049] (a)RNA的提取
[0050] 以甘藍(lán)型油菜不育株7365A植株的花蕾為材料，根據(jù)Trizol提取試劑盒的要求進(jìn) 行RNA的提取，用蛋白檢測(cè)儀（DU650BECKMAN，USA)分別檢測(cè)RNA在260nm和280nm下的 吸光值，結(jié)合1% (質(zhì)量體積比）瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和濃度。
[0051] (b)cDNA的合成
[0052] 以上述獲取的RNA為模板，按下列方案進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：2ygRNA中加入DNAase 1y1，DNAaseBuffer+Mgcl2ly1，DEPCH20 至 10y1，37°