一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗病毒藥物的制備技術領域，尤其涉及一種單磷酸阿糖腺苷的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 單磷酸阿糖腺苷（vidarabine monophosphate，Am-AMP)是 0 -D-阿糖腺苷 (Ara-A)的單磷酸化合物，是一種人工合成的腺嘌呤核苷類抗病毒藥。目前在我國主要用 于慢性病毒性肝炎、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、牛痘病毒以及多種動物皰疹病毒和少數(shù) 致癌RNA病毒等。單磷酸阿糖腺苷已在歐洲、美國、日本等許多國家上市。由于單磷酸阿糖 腺苷臨床用藥劑量很大，為滿足臨床用藥需要，適合工業(yè)化生產(chǎn)的單磷酸阿糖腺苷的合成 工藝開發(fā)非常必要。現(xiàn)有的單磷酸阿糖腺苷的制備方法主要有化學法、生物轉化法以及基 因工程法，化學法因研究開發(fā)技術比較成熟，目前市場上的單磷酸阿糖腺苷普遍采用化學 法制備。
[0003] 中國專利公布號CN103204890A公開了一種磷酸化制備單磷酸阿糖腺苷的方法， 具體的說，以阿糖腺苷為起始原料，經(jīng)惰性氣體保護在縛酸劑和催化劑的作用下經(jīng)磷酸化 后，通過活性炭脫色等后處理即得粗品單磷酸阿糖腺苷，此工藝路線簡單，成本低，收率高， 相對于現(xiàn)有技術，生產(chǎn)過程毒性大大降低，適合工藝化生產(chǎn)。但是該方法使用惰性氣體保 護，在縛酸劑和催化劑的作用下反應，反應后產(chǎn)生大量含有有機溶劑和三氯氧磷的廢液，三 氯氧磷遇水蒸氣分解成磷酸與氯化氫，含磷可致磷中毒，對皮膚、粘膜有刺激腐蝕作用，毒 性與光氣類似。短期內吸入大量蒸氣，可引起上呼吸道刺激癥狀、咽喉炎、支氣管炎；嚴重 者可發(fā)生喉頭水腫室息、肺炎、肺水腫、紫紺、心力衰竭。亦可發(fā)生貧血、肝臟損害、蛋白尿， 與眼和皮膚接觸引起灼傷。長期低濃度接觸可引起口、眼及呼吸道刺激癥狀，對環(huán)境污染較 大。
[0004] 中國專利公布號CN 104372050 A公開了一種單磷酸阿糖腺苷的方法，通過先制備 共表達嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌，再利用該基因工程菌制備單磷酸 阿糖腺苷的方法。于通過分子克隆的方法在基因工程菌中共同表達嘌呤核苷磷酸化酶和尿 苷磷酸化酶，獲得具有高酶比活的阿糖腺苷生物轉化菌，應用本發(fā)明得到的菌體生產(chǎn)阿糖 腺苷，將得到的阿糖腺苷經(jīng)惰性氣體保護在縛酸劑、催化劑的作用下經(jīng)磷酸化后，處理即得 單磷酸阿糖腺苷。最終還是將得到的阿糖腺苷經(jīng)惰性氣體保護在縛酸劑、催化劑的作用下 經(jīng)磷酸化后，處理即得單磷酸阿糖腺苷，該方法與中國專利公布號CN103204890A -樣存在 著相同的問題。
[0005] 因此，亟需提供一種構思不同的單磷酸阿糖腺苷的制備方法，以解決上述問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，解決了現(xiàn)有技術中制 備單磷酸阿糖腺苷的過程對環(huán)境污染較大的技術問題。
[0007]本發(fā)明采用的技術手段如下：一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，以P -D-阿糖腺 苷為起始原料，加入反應酶進行酶促合成反應，經(jīng)析晶、過濾后既得所述單磷酸阿糖腺苷。
[0008] 具體地，包括如下步驟： 1)配制反應液：在溫度為25°C ~45°C的條件下，將ATP.Na2、0-D-阿糖腺苷、甘油、鎂離 子溶液攪拌得混合液，所述ATP.Na2、0 -D-阿糖腺苷、鎂離子溶液的摩爾質量比為1 :1~5 : 10~15 :0. 05~0. 2,在混合液中調節(jié)PH值至7. 5~9. 0,加入二硫蘇糖醇既得所述反應液。
[0009] 2)酶促合成反應：在所述反應液中加入濃度為10 5~10 3mmol/L反應酶進行酶促合 成反應，加入堿性溶液控制反應液的PH值為7. 6~8. 6,反應時間為24h~72h，完成酶促合成 反應。
[0010] 3)過濾析晶：將步驟2)中完成酶促合成反應的反應液冷卻至15°C ~24°C，過濾得 濾液，將所述濾液冷卻至_2°C ~14°C析晶，再過濾，干燥，既得所述單磷酸阿糖腺苷。
[0011] 其化學反應式如下：
優(yōu)選地，在步驟2)中，反應液的pH值不再變化時取樣做HPLC分析，當e-D-阿糖腺苷 含量小于3%時，完成酶促合成反應。
[0012] 優(yōu)選地，在步驟1)中，所述鎂離子溶液為醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂的一種。
[0013] 優(yōu)選地，在步驟2)中，所述合成酶為肌酸激酶、磷酸激酶、腺苷激酶的一種。
[0014]優(yōu)選地，在步驟2)中，在反應時間為24h后，每間隔6h~10h取樣做HPLC分析，當0 -D-阿糖腺苷含量小于3%時，完成酶促合成反應。
[0015] 優(yōu)選地，在步驟3)中，所述過濾為通過粗蛋白膜過濾。
[0016]優(yōu)選地，在步驟1)中，所述堿性溶液為氫氧化鈉溶液、濃氨水、碳酸氫鈉溶液、碳酸 鈉溶液的一種。
[0017] 采用本發(fā)明所提供的一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，相對于現(xiàn)有采用化學有機 溶劑制備單磷酸阿糖腺苷的方法，其成本較低，產(chǎn)品易分離純化，產(chǎn)品純度高，對環(huán)境污染 小。
【具體實施方式】
[0018] 以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于 限定本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1 一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，包括以下步驟： 1)配制反應液：向2L錐形瓶中分別加入700ml去離子水、1. lmol甘油、0. 4ml Triton X-100、0? 007mol 硫酸鎂和 0? lmol 的 ATP. Na2，然后攪拌下用 ION NaOH (約 15 ml ~20ml)調節(jié)溶液的PH值至7. 5±0. 1 ;向以上溶液中加124mg二硫蘇糖醇并攪拌溶解， 補加去離子水至總體積800ml ;加入0. lmol Ara-A，攪拌均勻后通過水浴加熱至內溫達到 27。。±2。。。
[0020] 2)酶促合成反應：溶液加入肌酸激酶，使其濃度為1. 0X 10 3mmol/L，水浴加熱保 溫27°C ±2°C并開始計時反應；反應期間需要及時檢測溶液的PH值，當PH值至7. 2±0. 3 是向溶液中緩慢加入氨水使PH值恢復至7. 5±0. 1 ;保溫反應時間36小時以后每間隔10h 取樣HPLC分析，當Ara-A < 3%時反應結束。
[0021] 3)過濾析晶：1、析晶：反應完成后將溶液冷卻至15°C，然后通過粗蛋白膜過濾；濾 液冷卻至l〇°C;大量固體析出后降溫至0°C，保溫攪拌5小時后過濾。2、溶解：攪拌狀態(tài)下， 400ml 0.25N NaOH溶液中分批加入固體，加入期間溶液溫度控制在10°C ;全部加完后繼續(xù) 攪拌50min后測PH值，加入10N NaOH使最終PH值達到6. 0±0. 1。3、析晶：保溫在10°C的 條件下，加入6N HC1使溶液PH值達到1. 8±0. 05 ;然后降溫至0°C并保溫攪拌5小時后析 晶結束。4、過濾、干燥：抽濾至無明顯流出液，然后用20L 0.01N HC1水溶液淋洗，濕品在 50°C鼓風干燥5h后，既得成品單磷酸阿糖腺苷，收率為77. 15%，純度為99. 6%。
[0022] 實施例2 一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，包括以下步驟： 1)配制反應液：向2000L反應釜中分別加入700L去離子水、llOOmol甘油、0. 4L Triton X-100、9.03mol 氯化鎂和 lOOrnol ATP.Na2;然后攪拌下用 10N NaOH (約 15-20L)調 節(jié)溶液的PH值至9.0±0. 1 ;溶液中加124g二硫蘇糖醇和分批加入lOOmol Ara-A，加入期 間攪拌速度至60Hz，攪拌均勻后再次檢測PH值并可用氨水調節(jié)PH值至9. 0±0. 1，控制反 應溫度為32°C ±2°C。
[0023] 2)酶促合成反應：攪拌速度降至35Hz，向以上溶液中加入肌酸激酶，使其濃度為 1. 0X 10 5mmol/L，反應釜密閉狀態(tài)下保溫32°C ±2°C開始計時反應；反應期間及時檢測溶 液PH值，當PH值至7. 2 ± 0. 3時是向溶液中緩慢加入氨水使PH值恢復至9. 0 ± 0. 1 ;檢測溶 液PH值為反應前6h內每60min檢測一次，4h~24h內每lh~2h檢測一次，24h以后每3~5h 檢測一次。保溫反應時間72小時以后每6小時取樣HPLC分析，當Ara-A < 1%時反應結束。
[0024] 3)過濾析晶：反應完成后將溶液冷至18°C，然后通過粗蛋白膜過濾；濾液進入 3000L反應釜，并冷卻至5°C;保溫子5°C的條件下，加入6N HC1使溶液PH值達到1. 2±0. 1。 控制溶液溫度為5°C的條件下，加入Ara-AMP晶種85g，然后保溫攪拌至大量固體析出 后降溫至0°C，保溫攪拌5小時后每隔2h測上清0D，至兩次相差小于3%后溶液溫度降 至-2°C ±1°C，然后保溫攪拌5小時；離心至無明顯流出液，然后用25L 0. 01N HC1水溶液 淋洗，再離心2小時后取出固體。
[0025] 4)重結晶：1、溶解：攪拌狀態(tài)下，400L 0. 25N NaOH溶液中分批加入固體，加入期 間溶液溫度控制在15°C ;全部加完后繼續(xù)攪拌60分鐘后測PH值，加入ION NaOH使最終使 PH值達到6. 0±0. 1