用于孔石莼lamp-lfd檢測的引物和探針序列的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測孔石莼的引物和探針序列，尤其是涉及一種用于孔石莼 LAMP-LFD檢測的引物和探針序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 孔石藥（ZZ/rapertofa)屬于綠藻綱，石藥目，石藥科，石藥屬。石藥屬（ZZ/ra)藻 類呈全球性分布，多數(shù)種類生活在溫帶至亞熱帶海洋中，部分生長在高潮帶至低潮帶和大 干潮線附近巖石上或石沼中。石莼屬藻類富含蛋白和多種微量元素，具有很高的食用及藥 用價(jià)值。作為重要的經(jīng)濟(jì)藻類，孔石藥（KjOeriiAsa)、消1苔（ZZ/ra 等已得到越 來越多的開發(fā)利用。然而，當(dāng)石莼屬藻類脫離固著基，形成大量的漂浮增殖群體時(shí)，將導(dǎo)致 綠潮的爆發(fā)，破壞底棲生態(tài)系統(tǒng)。自20世紀(jì)70年代初法國布列塔尼沿海首次報(bào)道以來，綠 潮發(fā)生范圍已遍及歐洲沿海、美國東西海岸、東亞和東南亞沿海以及澳大利亞等國，成為世 界性的海洋環(huán)境問題。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測孔石莼的新方法，對于綠潮的早期 判斷和預(yù)警、實(shí)時(shí)監(jiān)測及防治具有重要的意義。
[0003] 長期以來，石莼屬等綠潮藻的分類鑒定主要依賴于顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，通常 以其形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征等作為主要的分類依據(jù)。然而，石莼屬藻類在生長時(shí)期其形態(tài)和細(xì)胞結(jié) 構(gòu)上有著很好的可塑性，會隨著季節(jié)和環(huán)境的變化而變化，導(dǎo)致形態(tài)學(xué)分類比較困難。因 此，有學(xué)者試圖將以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)引入到綠潮藻類的檢測中，以期對傳統(tǒng) 分類方法加以輔助。其中，rDNA-ITS序列、rDNA-18s序列、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基 因（rbcL)等因其種間較大的差異性，通常用作鑒定的靶標(biāo)，應(yīng)用于藻類的系統(tǒng)分類和鑒定 過程。然而，PCR技術(shù)對儀器依賴性高，需要在特定環(huán)境下由專業(yè)人員操作，只適合在實(shí)驗(yàn) 室開展。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 2000 年 發(fā)展起來的一種新的核酸擴(kuò)增方法。相對于僅需設(shè)計(jì)1對上下游引物以擴(kuò)展的傳統(tǒng)PCR法， 該方法需針對一段靶序列的不同區(qū)域設(shè)計(jì)2-3對引物，這些引物在反應(yīng)過程中需完全與靶 序列匹配才能完成擴(kuò)增反應(yīng)。因此，LAMP具有高特異性和高靈敏度。LAMP反應(yīng)在恒溫條件 下進(jìn)行，無需反復(fù)的升降溫以使模板解鏈，一定程度上縮短了檢測時(shí)間。此外，該技術(shù)對儀 器設(shè)備要求低，僅一臺恒溫水浴鍋或金屬浴即可滿足反應(yīng)條件。因而，自該技術(shù)發(fā)明以來已 廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原檢測中。但是，LAMP產(chǎn)物的檢測以瓊脂糖凝膠電泳法 或濁度檢測為主，在這點(diǎn)其仍然無法擺脫凝膠成像系統(tǒng)或濁度儀。LAMP-LFD技術(shù)以LAMP反 應(yīng)為基礎(chǔ)，隨后將生物素標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交， 最終在橫向流動(dòng)試紙條上完成檢測并進(jìn)行結(jié)果判定。相較于之前的LAMP產(chǎn)物檢測方法， LFD便攜性較好，且能夠避免非特異性擴(kuò)增而出現(xiàn)的假陽性。目前，該技術(shù)已成功運(yùn)用于傳 染性脾腎壞死病毒（//LfeciioiA? Ki/m^ISKNV)、傳染性肌肉 壞死病毒κ/τ?Λ?，IMNV)、創(chuàng)傷弧菌以及 海豚鏈球菌（5'^6>/76^〇1?〇1?1^61/^ (36〇等水產(chǎn)病原微生物的檢測，國內(nèi)外還未見報(bào)道將該技 術(shù)應(yīng)用于孔石莼的診斷和檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測速度快，檢測成本低，檢測靈敏度和 準(zhǔn)確性高的用于孔石莼LAMP-LFD檢測的引物和探針序列。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于孔石莼LAMP-LFD檢測 的引物和探針序列，根據(jù)基因庫登錄號為HQ902008的孔石莼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的編碼序 列設(shè)計(jì)LAMP的三對引物序列和一條探針序列，引物序列具體如下： UpeITS-F3 :5' -TAGCCTCACCTGAACTCAG-3' UpeITS-B3 :5' -ACGGATATCTCGGCTCTC-3'， UpelTS-FIP:5' -CGGCTGAAATACAGAGGCTCGTATCCTTCGTGGCTCACA-3'， UpelTS-BIP:5' -GTTATTCCGACGCTGAGGCAGCAGAATTCCGTGAGTCAT-3'， UpeITS-LF:5' -TAGGTAGCTCGCTACTCCTAC-3'， UpeITS-LB:5' -GTGGTCTCATCCGAAGACTC-3'，UpelTS-FIP的 5' 端為生物素標(biāo)記； 探針序列如下： UpeITS-ΗΡ:5' -GCAAGCGCGTGAGGGGTTAT-3'，5' 端為異硫氰酸熒光素標(biāo)記。
[0007] 引物工作的LAMP反應(yīng)體系：反應(yīng)體系各成分的終濃度分別為：外引物UpeITS-F3 和UpeITS-B3 各 0· 2Mmol/L，內(nèi)引物UpelTS-FIP和UpelTS-BIP各 1. 6Mmol/L，環(huán)引物 UpeITS-LF和UpeITS-LB各0.4Mmol/L，dNTPs1.4mmol/L，pH8.8 的Tris-HCl20mmol/L， KC1 10mmol/L，MgS04 6 . 5mmol/L，（NH4)2S04 10mmol/L，TritonX-100 0· 1%，8UBstDNA聚 合酶大片段和2μL樣品模板，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25μL。
[0008]LAMP反應(yīng)條件：將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為63°C，擴(kuò)增反應(yīng) 時(shí)間為50min。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1、檢測靈敏度高，對孔石莼基因組的檢測靈敏度為3. 04X10 2pg/μL，是常規(guī)PCR檢測 的1000倍。
[0010] 2、檢測時(shí)間短，擴(kuò)增反應(yīng)只需50min，從核酸擴(kuò)增開始到完成結(jié)果判斷，整個(gè)流程 僅需60min，比常規(guī)PCR檢測技術(shù)縮短約1. 5h。
[0011] 3、特異性強(qiáng)，所用的特異性引物根據(jù)孔石莼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中的八個(gè)不同區(qū)域設(shè) 計(jì)，并且還有DNA的特異性探針，可有效避免利用瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料等方法引起的 假陽性問題。
[0012] 4、儀器設(shè)備要求低，無需常規(guī)PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)等，只需一 個(gè)水浴鍋即可完成檢測。
[0013] 5、操作簡單，結(jié)果明顯，整個(gè)檢測過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，稍具分子生物學(xué)基 礎(chǔ)的人員即可完成操作；檢測結(jié)果清晰明顯，肉眼觀察即可判斷。
[0014] 6、對人身和環(huán)境更加安全，檢測過程中不涉及EB等有毒試劑。
[0015] 綜上所述，使用本發(fā)明的引物和探針采用LAMP-LFD方法對孔石莼進(jìn)行檢測，具有 更高的快捷性、特異性和靈敏度，儀器需求簡單，有利于孔石莼的早期診斷和檢測，可滿足 基層檢測機(jī)構(gòu)的需要。
【附圖說明】
[0016] 圖 1 為LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Μ: 100bpPlusDNAladder(Fermentas,美國）； Upe:以孔石藥S66 的基因組DNA為模板；Ufl、Uli、Uoh、Upr、Ata、Gin、Hak、Pdo、Str:分別 以曲滸苔SDF12、緣管滸苔HS42、FJ4、滸苔XS5、塔瑪亞歷山大藻NMBjah048、無 紋環(huán)溝藻NMBjah046、赤潮異彎藻H1、東海原甲藻NMBjah045、錐狀斯克里普藻NMBjah044的 基因組DNA為模板；NC:以無菌去離子水作為模板； 圖2為LAMP-LFD特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Upe:以孔石莼S66的基因組DNA為模板；Ufl、Uli、Uoh、Upr、Ata、Gin、Hak、Pdo、Str:分別以曲消1 苔SDF12、緣管消1 苔HS42、FJ4、 消1苔XS5、塔瑪亞歷山大藻NMBjah048、無紋環(huán)溝藻NMBjah046、赤潮異彎藻HI、東海原甲藻 NMBjah045、錐狀斯克里普藻NMBjah044的基因組DNA為模板；NC:以無菌去離子水作為模 板； 圖 3 為LAMP檢測的靈敏度結(jié)果。M:100bpPlusDNAladder(Fermentas,美國）； 3· 04Χ102、3· (ΜΧΙΟ1』· 04Χ10°、3· 04X10 \3· 04X10 2、3· 04X10 3:以孔石莼不同濃度 的基因組DNA為模板(單位：pg/^L);NC:以無菌去離子水作為模板； 圖 4 為LAMP-LFD檢測的靈敏度結(jié)果。3· 04X102、3· 04XΙΟ1』· 04X10°、3· 04X10 \ 3. 04X10 2、3. 04X10 3:以孔石莼不同濃度的基因組DNA為模板(單位：pgMJ;NC:以無菌 去離子水作為模板； 圖 5 為PCR檢測的靈敏度結(jié)果。M:100bpPlusDNAladder(Fermentas,美國）； 3· 04Χ102、3· (ΜΧΙΟ1』· 04Χ10°、3· 04X10 \3· 04X10 2、3· 04X10 3:以孔石莼不同濃度 的基因組DNA為模板(單位：pg/^L);NC:以無菌去離子水作為模板。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0018] 實(shí)施例1 LAMP-LFD技術(shù)檢測孔石莼的方法的建立 1.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的孔石莼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（GenBank登錄號