一種基于閉合環(huán)路的循環(huán)腫瘤細胞分離富集裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)和生物分離富集裝置，特別涉及一種循環(huán)腫瘤細胞分離富集
目.0
【背景技術(shù)】
[0002]循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumour cell, CTC)指因為侵襲、脫落、手術(shù)操作等內(nèi)外部因素導(dǎo)致的進入血液循環(huán)的腫瘤細胞。CTC的檢測可有效地應(yīng)用于體外早期診斷，化療藥物的快速評估，個體化治療包括臨川篩藥、耐藥性的檢測，以及腫瘤新藥物的開發(fā)等。外周血CTC的數(shù)目被證實可以作為肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多數(shù)腫瘤患者預(yù)后標志，或者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(Joosse SA, Gorges TM, Pantel K.: “B1logy, detect1n, andclinical implicat1ns of circulating tumor cells.，，，EMBO Mol Med.2014, 14 ；7(1):1-11) o
[0003]目前，CTC檢測手段種類繁多、原理各異。然而，由于循環(huán)腫瘤細胞在外周血中豐度極低，約0.3-100個/ml，與白細胞相差4-7個數(shù)量級，如何高效率、高純度地分離CTC一直是研究的熱點?，F(xiàn)有CTC分離富集技術(shù)主要包括密度梯度離心，免疫磁珠分離，過濾分離，微流控芯片等。比如，基于免疫磁珠的分離富集方法的CellSearch? System，可重復(fù)性好，敏感性高，CTC檢出率達到70% -85%，被認為是當今CTC檢測金標準；微流控芯片技術(shù)使待檢血樣以特定流速流過微米級的通道，通道中立有上萬個微柱，每個微柱上包被有抗EpCAM抗體以捕獲循環(huán)腫瘤細胞，其CTC檢出率達到了 99% (Nagrath S, SequistLV, Maheswaran S，et al: “Isolat1n of rare circulating tumour cells in cancerpatients by microchip technology.，，，Nature 2007, 450 (7173): 1235-1239);體外過濾分離(ISET)技術(shù)利用散布有直徑8 μπι小孔的聚碳酸酯濾膜分離循環(huán)腫瘤細胞，該方法避免了抗原抗體結(jié)合的局限性，操作簡便，細胞損傷較少，可以檢測出混入Iml血液中的I個腫瘤細胞，敏感性高。但是，這些方法在每次抽取5-10ml血液后，從中分離和富集的CTC數(shù)量極為有限(一般為0-20個/7.5ml);
[0004]此外，在實際應(yīng)用中，從每次抽取5-10ml的血液量中富集到的CTC數(shù)量基本不能完成或者說很難完成CTC培養(yǎng)的需要，例如:如果在富集CTC后進行基因測序，則需要經(jīng)過繁雜的單細胞預(yù)擴增，其價格昂貴，操作繁瑣，技術(shù)難點大；而如果通過重復(fù)上述CTC檢測實驗來提高CTC富集量，不但成本高，而且反復(fù)抽取檢測血液，亦會使得血液損失量大?，F(xiàn)有的CTC分離和富集技術(shù)存在著的上述缺陷，限制了與其相關(guān)的CTC檢測技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就在于解決上述問題，提供一種基于閉合環(huán)路的循環(huán)腫瘤細胞分離富集裝置。在該裝置的閉合循環(huán)回路中，含有循環(huán)腫瘤細胞的液體在經(jīng)過該裝置采集循環(huán)腫瘤細胞過濾器的過濾后被回輸入體內(nèi)，如此循環(huán)往復(fù)，從而在不造成血液損失的情況下，不斷使循環(huán)腫瘤細胞富集在濾膜上，同時也可以達到盡可能除盡液體中的循環(huán)腫瘤細胞的效果。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]本發(fā)明提供了一種基于閉合環(huán)路的循環(huán)腫瘤細胞分離和富集裝置，其特征在于:包括采集通道1、抗凝通道2、控制閥3、采血儀4、采血袋5、循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器6和血液回輸通道7。所述采集通道I和抗凝通道2的輸出端可以通過連接部件(如三通)匯合后與控制閥3的輸入端連接，也可以分別直接連接控制閥3的輸入端；控制閥3至少具有三個出/入口，可以至少完成兩個通道的切換；控制閥3的一個切換端與采血袋5的輸入端連接；采血袋5的輸出端依次與循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器6和血液回輸通道7連接，可以在采血袋5輸出端外部采用扎結(jié)連接軟管或者設(shè)置夾緊部件(如:止液夾等)的形式控制液體流出；該血液回輸通道7的輸出端與控制閥3的另一個切換端連接，至此，形成完整的閉合環(huán)路。采血袋5在血液采集階段放置于采血儀4上，采血儀4需要放置于低于采集通道I入口的位置，通過震動使采血袋4中血液與抗凝劑充分混勻，并且能定量采集液體體積；在血液回輸階段時，采血袋5的位置需高于回輸通道7的輸出端，以使得采血袋5中的液體在重力的作用下回輸?shù)襟w內(nèi)。采血袋5的位置可以通過人工手動或者升降裝置調(diào)節(jié)，以轉(zhuǎn)換血液采集階段與血液回輸階段的循環(huán)過程，以及調(diào)節(jié)采血袋5到合適的操作位置。
[0008]可選地，所述循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器6由上、下兩部分組成，中間壓入CTC富集濾膜，可通過打開過濾器6上、下兩部分來重裝或者更換CTC富集濾膜。所述循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器6中的CTC富集濾膜是一張孔徑一致，并規(guī)則排布有微孔的濾膜，以紫外光刻技術(shù)和反應(yīng)離子蝕刻技術(shù)制造，其材質(zhì)為派瑞林(聚對二甲苯)薄膜，膜厚度為2-20 μ m，膜孔徑在6-40 μ m，膜面積為0.2-20cm2，膜含有濾孔為10000-1000000個。該濾膜沒有特異性，主要靠孔徑大小把腫瘤細胞與血液中的其他細胞區(qū)分開來。一般腫瘤細胞直徑>10 μπι，人體血液中正常白細胞和紅細胞的直徑〈10 μ m，因而通過濾膜，可以截留腫瘤細胞，而使人體所需的白細胞和紅細胞回輸人體。
[0009]可選地，所述采血儀4置于低于采集通道I入口 0.5-1.5m位置，震動頻次為20-40次，米集液體總體積為20-500ml。
[0010]可選地，回輸通道7在液體回輸時，其位置低于采血袋0.5-1.5m。
[0011]可選地，在循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器6與血液回輸通道7還連接有流速控制器9，可以根據(jù)患者需求調(diào)節(jié)液體回輸流速，增加舒適度。
[0012]可選地，所述流速控制器9將血液回輸速度控制在1-180滴/分鐘，即0.06-12ml/分鐘(15滴/ml)。
[0013]可選地，根據(jù)本發(fā)明的裝置，所述抗凝通道2中含有肝素和生理鹽水配合而成的抗凝劑，抗凝劑濃度為V肝素:V生理鹽水=1:1 ~ 1:100ο
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于:
[0015]I)該裝置的閉合環(huán)路一方面達到了在過濾富集腫瘤細胞的基礎(chǔ)上，將剩余液體成功地回輸入體內(nèi)，從而不損失液體的有益效果；另一方面全程封閉的通路可以確?；剌?shù)难翰皇艿饺魏挝廴荆踩煽俊?br>[0016]2)在達到了采集血液回輸、不造成液體損失的基礎(chǔ)上，該裝置能夠進行循環(huán)反復(fù)采集血液，從而提高了循環(huán)腫瘤細胞的富集率。CTC富集率在單次循環(huán)后達到95-100%，多次循環(huán)后可以使得CTC富集數(shù)目達到20-100個，為后續(xù)細胞表征鑒定、基因檢測提供了技術(shù)保障。
[0017]3)本裝置摒棄了經(jīng)常采用的使用加壓或者負壓吸引的方式形成血液采集回輸連續(xù)循環(huán)的操作方法，而是通過變換采血袋相對于采集/回輸通道的高低位置來操作血液采集或者回輸?shù)倪^程。這樣可以簡化操作系統(tǒng)配置，并且使得整個采集過程便于控制，有效延長血液與抗凝劑的混合時間，避免閉合環(huán)路由于血液凝結(jié)而形成堵塞。
【附圖說明】
[0018]圖1:基于閉合環(huán)路的循環(huán)腫瘤細胞分離和富集裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖2:CTC免疫熒光圖。
[0020]圖中各標號表示對應(yīng)的部件名稱如下:
[0021]1.采集通道；2.抗凝通道；3.控制閥；4.采血儀；5.采血袋；6.循環(huán)腫瘤細胞采集過濾器；7.血液回輸通道；8.止液夾；9.流速控制器。
【具體實施方式】
[0022]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步的介紹。
[0023]如圖1所示:
[0024]所述基于閉合環(huán)路的循環(huán)腫瘤細胞分離和富集裝置，包括采集通道1，抗凝通道2，控制閥3，采血儀4，采血袋5，循環(huán)腫瘤細胞