一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法。剪取成年豬皮膚，去除毛發(fā)、脂肪和污垢后于75%酒精浸泡，用PBS清洗后剪成小塊，0.25%Trypsin中4℃消化過夜；皮膚塊經(jīng)DMEM高糖培養(yǎng)液清洗，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化、吹打后過400目細(xì)胞篩得到細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入豬皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；原代培養(yǎng)3-4天的成年豬皮膚經(jīng)PBS清洗，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗、消化，輕敲平皿側(cè)壁使細(xì)胞脫落，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，離心后棄上清將細(xì)胞重懸后傳代。本發(fā)明方法操作簡便，可重復(fù)性好，培養(yǎng)的成年豬干細(xì)胞表達(dá)β1-integrin和Nestin等皮膚干細(xì)胞特異蛋白，并且是堿性磷酸酶陽性。
【專利說明】一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:[0001]本發(fā)明涉及一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法，屬于生物醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞與組織工程學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】:
[0002]干細(xì)胞(stem cells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cell, ESC)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)。胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育的全能性,但是它只存在于胚胎發(fā)育早期，因此其獲得性以及倫理問題限制其進(jìn)一步的研究及應(yīng)用。
[0003]成體干細(xì)胞雖然沒有胚胎干細(xì)胞發(fā)育全能性方面的優(yōu)勢，但是其取材方便，來源廣泛，并且仍保留向多種細(xì)胞類型分化，因此成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及功能研究成為近年來研究的熱點(diǎn)。皮膚干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能干細(xì)胞。這種細(xì)胞聚居于皮膚組織的基底層以及毛囊等部位，一旦需要，便可按特定發(fā)育途徑分化產(chǎn)生出另外一群具有有限分裂能力的細(xì)胞群，是表皮、皮脂腺和毛囊細(xì)胞更新和修復(fù)的細(xì)胞來源。對皮膚干細(xì)胞的研究有助于皮膚組織再生，毛囊及附屬器官再生及治療脫發(fā)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。
[0004]成年豬皮膚外側(cè)被覆堅硬毛發(fā)，內(nèi)側(cè)則密布脂肪及結(jié)締組織，干細(xì)胞數(shù)量有限，因此其體外分離培養(yǎng)有一定的難度，并且目前國內(nèi)外研究中由于對組織內(nèi)成體皮膚干細(xì)胞缺乏有效的分離培養(yǎng)方法，阻礙了該領(lǐng)域研究的深入發(fā)展。如何高效獲得具有良好生物學(xué)性能的干細(xì)胞，是目前成體干細(xì)胞研究急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種成年豬皮膚干細(xì)胞(PorcineSkin-Derived Stem Cells)體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法。本發(fā)明方法分離成年豬皮膚，剪掉外側(cè)毛發(fā)并分離內(nèi)側(cè)脂肪，將皮膚塊剪碎消化吹打?yàn)閱渭?xì)胞并過400目細(xì)胞篩后，體外培養(yǎng)成年豬皮膚干細(xì)胞，成功獲得大量狀態(tài)良好的成年豬皮膚干細(xì)胞。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明方法按照如下步驟操作:第一步，成年豬皮膚分離與清洗:剪取成年豬皮膚，剪掉皮膚外側(cè)毛發(fā)，并用彎角鑷刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結(jié)締組織剪干凈，于75%酒精浸泡5分鐘進(jìn)行滅菌處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)清洗三次除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；第二步，原代培養(yǎng)成年豬皮膚干細(xì)胞:皮膚塊經(jīng)DMEM/F12(細(xì)胞培養(yǎng)液Dulbecco’ sModified Eagle Medium, F_12Nutrient Mixture)清洗，置于 0.25%Trypsin_0.04%EDTA,37 °C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，將細(xì)胞懸液過400目細(xì)胞篩，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為原代，每3-4天傳代一次；第三步，傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)3-4天的成年豬皮膚經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)洗兩遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗，之后加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側(cè)壁使細(xì)胞從皿底脫落，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000轉(zhuǎn)/秒離心5分鐘后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸按照I板細(xì)胞傳代為2板或者3板細(xì)胞的比例進(jìn)行傳代。
[0007]本發(fā)明方法第二步所述皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12 ; 10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生長因子；40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子；1%青鏈霉素。
[0008]本發(fā)明方法建立了成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法，從有限的材料來源獲得大量的成體動物的皮膚干細(xì)胞，操作簡便，可重復(fù)性好，為成體豬皮膚干細(xì)胞體外培養(yǎng)及研究應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0009]圖1為成年豬皮膚干細(xì)胞體外培養(yǎng)顯微圖。
[0010]圖2為成年豬皮膚干細(xì)胞體外增殖生長曲線圖。
[0011]圖3為成年豬皮膚干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色圖。
[0012]圖4為成年豬皮膚干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0013]下面通過附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明方法做進(jìn)一步闡述。
[0014]實(shí)施例1、成年豬皮膚干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)
[0015]本方法中皮膚干細(xì)胞(SDSCs)來自于成年豬皮膚。
[0016]第一步，成年豬皮膚分離與清洗:剪取出欄成年母豬背部、肚皮部等部位的皮膚，剪掉皮膚外側(cè)毛發(fā)，并用彎角鑷刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結(jié)締組織盡量剪干凈，于75%酒精浸泡5分鐘進(jìn)行滅菌處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)清洗三次除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin (Hyclone公司)中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；
[0017]第二步，原代培養(yǎng)成年豬皮膚干細(xì)胞:皮膚塊經(jīng)DMEM/F12(Hycl0ne公司)清洗3遍后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)，37°C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12 (Hyclone公司)中洗I遍，將細(xì)胞懸液過400目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)入成體皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12(Hyclone公司);10%胎牛血清；2%B27 (Gibco公司)；20ng/ml表皮生長因子(EGF，Sigma公司)；40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF, Peprotech公司)；1%青鏈霉素(Hyclone公司)，以培養(yǎng)當(dāng)天為零代，每4天傳代一次。圖1所示為成年豬皮膚干細(xì)胞體外培養(yǎng)顯微圖。圖1中I為過細(xì)胞篩后單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)I天后細(xì)胞數(shù)目增多并開始貼壁(圖1中2)，傳代I次后成年豬皮膚干細(xì)胞完全鋪貼壁并鋪展開，呈上皮樣細(xì)胞貼壁狀態(tài)(圖1中3)。
[0018]第三步，傳代培養(yǎng):將不同傳代次數(shù)的成年豬皮膚干細(xì)胞經(jīng)pH7.0的PBS洗兩遍，加入 0.5ml0.25%Trypsin_0.049f)EDTA (Hyclone 公司)潤洗，之后加入
1.5ml0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側(cè)壁使細(xì)胞從皿底脫落，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000轉(zhuǎn)/秒離心5分鐘后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸按照I板細(xì)胞傳代為2板或者3板細(xì)胞的比例進(jìn)行傳代。在傳代過程中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。傳代培養(yǎng)1-5代成年豬皮膚干細(xì)胞數(shù)分別為:1.2X104、2.3Χ104、5.3Χ104、7.2Χ104、10.I X 10Vml0
[0019]繪制成年豬皮膚干細(xì)胞體外增殖生長曲線，得到成年豬皮膚干細(xì)胞體外增殖生長曲線如圖2所示，橫坐標(biāo)表示成年豬皮膚干細(xì)胞傳代次數(shù)，縱坐標(biāo)表示成年豬皮膚干細(xì)胞傳代過程中每代細(xì)胞數(shù)(I X 104)。
[0020]實(shí)施例2、成年豬皮膚干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色
[0021]將成年豬皮膚干細(xì)胞在PBS中洗3次后，置于4%多聚甲醛(索萊寶公司)室溫固定15分鐘，同時按如下方式配置磷酸酶染色工作液:
[0022]
?性色緩沖液(鈣云天公司)3 ml
BCIP灌液(300X,碧云天公司)10 μ?
NBT 潘液(150Χ, S 云天公-> ?J)20 μ?
BCIP/NBT 染色 J '.作液3.03 ιιι!
[0023]固定結(jié)束后，PBS洗滌3次，最后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。室溫避光孵育5-30分鐘或更長時間(可長達(dá)24小時)，直至顯色至預(yù)期深淺。去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)。對于組織切片或細(xì)胞樣品，顯色反應(yīng)終止后，如有必要可以用中性紅染色液(neutral redstaining solution)染色，以便于觀察。圖3為成年豬皮膚干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色，顯示成年豬皮膚干細(xì)胞為堿性磷酸酶陽性(藍(lán)紫色)。
[0024]實(shí)施例3、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)分析成年豬皮膚干細(xì)胞特定基因表達(dá)
[0025]取出傳代兩次成年豬皮膚干細(xì)胞，消化為單細(xì)胞后，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛(索來寶公司)室溫固定15分鐘?；騊BS洗3遍，每遍5分鐘。用PBST(PBS+0.5%Tr it ion-100)溶液進(jìn)行透化，室溫10分鐘。PBS (磷酸鹽緩沖液，pH7.0)洗I遍，5分鐘。加入含10%山羊血清或馬血清(索來寶公司)的PBST(PBS+0.5%Trition-100)，室溫封閉30 — 60分鐘。棄封閉液，加入一抗(I: 200, abeam公司)稀釋于封閉液中，4°C過夜或37°C孵育2小時。I %BSA (牛血清白蛋白，索萊寶公司)的PBS洗3遍,每遍5分鐘。加入二抗(1:200,碧云天公司)稀釋于二抗稀釋液中，37°C避光放置I小時。PBS洗3遍，每遍5分鐘。加入終濃度的DAPI (碧云天公司)，室溫放置5分鐘。PBS洗3遍，每遍5分鐘。加入500μ1 PBS或PBS甘油(1:1)在熒光顯微鏡下拍照或避光保存。圖4中1-3說明SDSCs呈β rintegrin陽性并在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，圖4中4-6說明SDSCs呈Nestin陽性并在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。
【權(quán)利要求】
1.一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法，其特征在于按照如下步驟操作:第一步，成年豬皮膚組織分離與清洗:剪取成年豬皮膚，剪掉皮膚外側(cè)毛發(fā)，并刮掉毛孔中污垢，將皮下脂肪及結(jié)締組織剪干凈，于75%酒精浸泡進(jìn)行滅菌處理，PH7.0磷酸鹽緩沖液清洗除去殘留酒精，將皮膚剪成2-3mm2小塊，置于0.25%Trypsin中4°C消化過夜以使皮膚變得松散；第二步，原代培養(yǎng)成年豬皮膚干細(xì)胞:皮膚塊經(jīng)DMEM/F12清洗，置于0.25%Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化30分鐘，移液器吹打皮膚塊，輕輕吹打混勻后加入10%胎牛血清終止消化，于DMEM/F12中清洗，并將細(xì)胞懸液過400目細(xì)胞篩，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，以培養(yǎng)當(dāng)天為原代，每3-4天傳代一次；第三步，傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)3-4天的成年豬皮膚干細(xì)胞經(jīng)pH7.0磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA潤洗，之后加入0.25%Trypsin-0.0496EDTA置于37°C消化10分鐘，輕敲平皿側(cè)壁使細(xì)胞從皿底脫落，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000轉(zhuǎn)/秒離心后棄掉上清液，加入新鮮皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸按照I板細(xì)胞傳代為2板或者3板細(xì)胞的比例進(jìn)行傳代；其中，所述皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/F12 ;10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生長因子；40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子；1%青鏈霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種成年豬皮膚干細(xì)胞體外高效分離培養(yǎng)的技術(shù)方法，其特征在于培養(yǎng)的成年 豬干細(xì)胞表達(dá)β fintegrin和Nestin皮膚干細(xì)胞特異蛋白，并且是堿性磷酸酶陽性。
【文檔編號】C12N5/071GK103468637SQ201310445509
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】孫源超, 王俊杰, 葛偉, 李蘭, 沈偉 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)