一種鴨細小病毒Taqman探針熒光定量PCR檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及一種鴨細小病毒Taqman探針熒光定量PCR檢測試 劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 鴨細小病毒是細小病毒的一種，主要侵害1~3周齡的雛鴨，臨床以腹瀉、呼吸困 難和腳軟為主要癥狀，一年四季均有發(fā)生，給鴨飼養(yǎng)帶來極大的經(jīng)濟損失，是鴨飼養(yǎng)中主要 的疾病之一，發(fā)病率和死亡率也較高。2015年3月以來，我國山東、江蘇和安徽等地肉鴨群 出現(xiàn)了一種疾病，該病以鴨喙發(fā)育不良，舌頭外伸為特征，本病主要發(fā)生在14日齡以上的 商品鴨，，雛鴨感染后主要表現(xiàn)為喙變短，舌頭暴露在外面，從而造成采食困難，體形消瘦， 料肉比增高。鴨群發(fā)病率為5% -20%不等，嚴重時可達50%左右；患鴨出欄體重較正常鴨 降低20% -30%，病程較長患鴨出欄時體重僅為健康鴨的一半，給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大 的經(jīng)濟損失。在種鴨泄殖腔拭子中能夠分離到該病毒，檢出率高達90%。在發(fā)病鴨群中的 表觀健康鴨的泄殖腔拭子亦可檢測到該病毒，檢出率為70 %左右。上述結(jié)果顯示，該病在鴨 群中具有的較強的傳播能力。
[0003] 熒光定量PCR又稱實時定量PCR，是在PCR技術的基礎上發(fā)展起來的一種高度靈敏 的核酸定量技術，能夠通過標準曲線對未知模板進行定量分析方法。它在核酸擴增體系中 引入熒光基團，通過對反應歷程中熒光信號的實時監(jiān)測，達到監(jiān)測整個實驗進程的目的，具 有靈敏、精確、特異等特點，極大的克服了傳統(tǒng)PCR技術普遍存在的假陽性及不能定量等問 題，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應模板進行準確定量。
[0004] TaqMan熒光定量PCR技術是以TaqMan熒光探針為基礎，利用DNA多聚酶的5' 一 3'外切酶活性來水解與目的序列雜交的探針。TaqMan熒光探針為一個20bp以上的寡核苷 酸，其5'端標記熒光發(fā)射基團，3'端標記淬滅基團。當探針保持完整時，3'端淬滅基團抑 制5'端發(fā)射基團的熒光發(fā)射，只能檢測到3'端熒光信號，而不能檢測到5'端的熒光信號。 在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物和探針同時與模板結(jié)合。在引物的介 導下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，TaqDNA聚合酶的5'一3'外切酶活性將探針5'端 連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3'端熒光淬滅基團的屏 蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光 信號的累積與PCR產(chǎn)物形成的完全同步。由于理論上被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù) 量是一對一的關系，且光密度同被釋放的熒光基團的數(shù)目也是正比關系，因此該技術可對 模板進行準確定量。TaqMan探針技術特異性好，假陽性低，線性關系好，準確性高。該方法 在臨床檢測和疾病診斷的評價上具有很高的實用價值。
[0005] 目前，還未見有應用Taqman熒光定量RT-PCR技術對鴨細小病毒進行檢測和診斷 的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種鴨細小病毒Taqman探針熒光定量PCR 檢測試劑盒及其應用，發(fā)明人提供了一對特異性引物及對應的熒光探針，之后利用已知鴨 細小病毒株基因組序列選取保守基因序列，利用基因克隆技術構(gòu)建含有該保守基因序列的 標準質(zhì)粒分子，進而獲得標準曲線，利用對應的熒光定量PCR技術即可對樣本進行檢測并 比對標準曲線即可判定樣本是否為陽性，這種方法特異性好，靈敏度高且線性關系好，操作 簡單，自動化程度高、防污染；使用Taqman熒光探針定量擴增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測， 不需要開蓋，不易污染。同時擴增和檢測一步完成，操作簡單，易于實現(xiàn)自動化。
[0007] 發(fā)明人首先提供了一對特異性引物，其核苷酸序列分別如SEQIDNo. 1和2所示， 同時提供了對應的TaqMan熒光探針，所述熒光探針的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示：
[0008] 正向引物為：TCATCAAGAATACACCAGTASEQIDNo. 1
[0009] 反向引物為：GTAITGAGTTATGTAGGAGITCSEQIDNo. 2
[0010] 探針序列為：CCTCCAGTAGAATATGTGAACCAGASEQIDNo. 3
[0011] 上述引物和熒光探針均設計在鴨細小病毒基因中的保守區(qū)，只對鴨細小病毒特 異，和其他物種無交叉反應；熒光探針應位于一對特異性引物之間的區(qū)域。
[0012] 之后發(fā)明人通過已知鴨細小病毒的公開序列獲得了其保守區(qū)域，該保守區(qū)域核苷 酸序列為TCATCAAGAATACACCAGTACCTGCAGACCCTCCAGTAGAATATGTGAACCAGAAGTGGAACTCCTACA TAACTCAATAC，如SEQIDNo. 4所示，之后利用基因克隆技術構(gòu)建含有該序列的標準品質(zhì)粒 分子，所用質(zhì)粒為PMD18-T，具體為：
[0013]利用DNA重組，構(gòu)建含有鴨細小病毒保守序列的標準質(zhì)粒，定量標準品質(zhì)粒8.8\101°。〇?168/^1，十倍稀釋至101°、10 9、108、107、106、105、10 4、103、102、101和 10° (copies/yL)各取2yL作為模板。
[0014]熒光定量PCR反應體系如下：
[0015] 卩代1111叉￡叉1&9 1〇1^;正向引物（1〇1^)0.41^;反向引物（1〇1^)0.41^;1?(? ReferenceDyeII0? 2uL;ddH20 6. 2uL;TaqMan探針（10uM) 0? 8uL;模板 2. 0uL〇
[0016] PCR反應程序：
[0017] 按照上述步驟配制PCR反應體系，放入熒光定量PCR儀中，反應程序：95°C預變性 30s，一個循環(huán)；95°C變性5s，60°C退火延伸34s，40個循環(huán)后反應結(jié)束。
[0018] 標準曲線的建立
[0019] 以上述制備的標準品為模板，按照以上體系及反應程序于熒光定量PCR儀中進行 PCR擴增，收集熒光信號，建立標準曲線。
[0020] 之后利用未感染鴨細小病毒的鴨DNA配制陰性PCR體系：PremixExTaq10yL; 正向引物 0.4uL;反向引物 0.4uL;RoxReferenceDyeII0.2yL;dH20 6.2uL;TaqMan 探針 0? 8yL;陰性DNA2. 0yL;
[0021] 而感染鴨細小病毒的鴨DNA制備陽性對照PCR反應體系：PremixExTaq10yL; 正向引物（1〇1^)0.41^;反向引物（1〇1^)0.41^ ;1?(?1^作代11。6〇76 110.21^;(1(扭20 6. 2yL;TaqMan探針（10yM) 0? 8yL;陽性DNA2. 0yL;
[0022] 利用上述相同的PCR反應程序得到反應產(chǎn)物，利用熒光PCR儀采集熒光信號，經(jīng)計 算機軟件生成陰性對照點和陽性對照點，陰性對照在檢測中無CT值并且無擴增曲線，陽性 對照點位于標準曲線上，并且其4值< 32。
[0023] 綜上所述，利用本發(fā)明提供的熒光定量PCR技術即可對樣本進行檢測并比對標準 曲線即可判定樣本是否為陽性，這種方法特異性好，靈敏度高且線性關系好，操作簡單，自 動化程度高、防污染；使用Taqman熒光探針定量擴增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要 開蓋，不易污染。同時擴增和檢測一步完成，操作簡單，易于實