同時(shí)檢測(cè)肉及肉制品中牛豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR方法及引物探針以 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman?LNA多重?zé)晒舛縋CR的方法。本發(fā)明利用序列相對(duì)較短但Tm較高的LNA探針序列，可在確保特異性的前提下，有效提高體系的穩(wěn)定性，建立了一套多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系，該體系能夠同時(shí)檢測(cè)牛、豬源性成分，可檢測(cè)肉或肉制品中DNA含量低至0.05ng的牛源性成分和0.05ng的豬源性成分，相當(dāng)于可檢測(cè)含量約0.005%的對(duì)應(yīng)動(dòng)物成分。本發(fā)明的方法具有通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、應(yīng)用性好等優(yōu)點(diǎn)，能較好應(yīng)用于肉及肉制品中牛、豬源性成分的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
同時(shí)檢測(cè)肉及肉制品中牛豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒?定量PCR方法及引物探針以及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛 豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的方法和引物探針組。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 肉或肉制品的摻假一直是消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一，有些不法商家為了個(gè)人利 益，以低價(jià)肉制品假冒高價(jià)肉制品，或在高價(jià)肉制品中摻入低價(jià)肉，這嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的 權(quán)益。目前，打擊肉制品摻假已成為監(jiān)管部門關(guān)注的重點(diǎn)，而肉或肉制品的成分檢測(cè)技術(shù)是 監(jiān)管的基礎(chǔ)。
[0004] 目前，動(dòng)物源性成分的檢測(cè)技術(shù)以檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法應(yīng)用最為廣 泛，尤其是PCR技術(shù)以穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)勢(shì)收到關(guān)注。其中，熒光定量PCR法在特異性、靈 敏度、重現(xiàn)性等方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)，成為該領(lǐng)域的主要技術(shù)之一。Taqman熒光PCR技術(shù)雖 然克服了普通PCR的上述缺點(diǎn)，但在探針設(shè)計(jì)時(shí)，需要通過較長(zhǎng)的探針序列來(lái)獲得較高的Tm 值，在特異性目標(biāo)基因序列較短的情況下，常常會(huì)因此難以找到理想的探針序列，無(wú)法獲得 高效、特異的擴(kuò)增效果，在檢測(cè)中不時(shí)發(fā)現(xiàn)這些方法存在一定的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。
[0005] Taqman-LNA熒光探針是在Taqman探針的基礎(chǔ)上，有目的地將探針的一些堿基修飾 成LNA堿基，通過提高探針的Tm值，縮短探針長(zhǎng)度來(lái)增加探針的穩(wěn)定性、特異性和設(shè)計(jì)的靈 活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)肉或肉制 品中牛豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的特異性引物探針組。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的 Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的方法； 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA 多重?zé)晒舛?PCR 的試劑盒； 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的引物探針組， 包括牛源性成分特異性引物和探針，豬源性成分特異性引物和探針，其核苷酸序列如表1所 示： 表1: Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的引物探針組 注:探針中的"C "為L(zhǎng)NA修飾堿基，F(xiàn)AM和ROX為熒光基團(tuán)，BHQ1和BHQ2為猝滅基團(tuán)。
[0008] 同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)試 劑盒，包括表2成分： 表2: Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的試劑盒組成
同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR的方法，包括以 下步驟： (1)待檢樣品DNA的提取。將樣品與水按照1:4的比例(M/V)進(jìn)行勻漿，取制備的懸濁液 50yL，采用試劑盒法提取DNA，但將DNA的定容體積改為100yL。試劑盒可選用Wizard Genomic DNA purification kit (Promega，A1120)、核酸提取試劑盒（達(dá)安基因，DA-Z146)、動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(迪奧生物，??04)等DNA提取試劑盒。
[0009] (2)多重?zé)晒舛縋CR。反應(yīng)體系見表3,熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的59°C階段結(jié)束后收集FAM和R0X的熒光信號(hào)。
[0010]表3:多重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)體系
(3 )結(jié)果判斷:根據(jù)FAM和R0X兩個(gè)通道下的循環(huán)閾值(Ct值)進(jìn)行判斷，其中FAM通道下 是牛源性成分的檢測(cè)，ROX通道下是豬源性成分的檢測(cè)。若陽(yáng)性對(duì)照Ct值<18,陰性對(duì)照無(wú) Ct值或Ct多30，則試驗(yàn)有效；當(dāng)樣品Ct值<25時(shí)判為陽(yáng)性，即樣品中含有牛源性成分(FAM 通道)和/或豬源性成分(R0X通道）；當(dāng)樣品Ct值多30或無(wú) Ct值時(shí)判為陰性，即樣品中不含 有牛源性成分(FAM通道)和/或豬源性成分(R0X通道）；當(dāng)25<樣本Ct值<30時(shí)須復(fù)檢，復(fù)檢 結(jié)果與原結(jié)果一致的判為弱陽(yáng)性，提示樣品中含有微量(被污染）的牛源性成分(FAM通道） 和/或豬源性成分(R0X通道）。
[0011] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)通量高。本發(fā)明可通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)牛、豬源性成分。
[0012] ⑵特異性強(qiáng)。本發(fā)明通過運(yùn)用牛、豬、雞、鴨、鸛、山羊、綿羊、驢、馬、鹿等動(dòng)物源性 成分樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證明本發(fā)明的高特異性。
[0013] (3)靈敏度高。本發(fā)明可檢測(cè)肉或肉制品中DNA含量為0.05ng的牛源性成分和 〇. 〇5ng的豬源性成分，相當(dāng)于可檢測(cè)含量約0.005%對(duì)應(yīng)動(dòng)物成分。
[0014] (4)應(yīng)用性好。本發(fā)明考慮初始模板量及該引物探針組的擴(kuò)增效率，引入弱陽(yáng)性的 界定方法，可指示樣本有無(wú)遭受微量被檢動(dòng)物成分的污染。
[0015]
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是Taqman-LNA多重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)牛、豬源性成分。
[0017] 圖2是本發(fā)明特異性測(cè)試。
[0018] 圖3是本發(fā)明靈敏度測(cè)試。
[0019]
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制 造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。
[0022] 實(shí)施例1 (l)DNA的提取 稱取相同重量的純牛肉和純豬肉樣本，再與水按照1:4的比例(M/V)進(jìn)行勻漿，取制備 的懸池液50yL，米用試劑盒法（Wizard Genomic DNA purification kit，A1120，Promega) 提取基因組DNA，最終DNA的定容體積為1 OOyL。
[0023] (2)Taqman_LNA 多重?zé)晒舛?PCR 反應(yīng)體系見表3,熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35個(gè)循 環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的59° C階段結(jié)束后收集FAM和R0X的熒光信號(hào)。
[0024] (3 )結(jié)果:FAM通道下Ct值為16.15，表明該樣品中含有牛源性成分，R0X通道下Ct值 為16.88,表明該樣品中含有豬源性成分。
[0025] 實(shí)施例2 用實(shí)施例1的方法分別對(duì)牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鵝血、山羊肉、綿羊肉、馬肉、驢肉、鹿 肉樣品進(jìn)行試驗(yàn)。
[0026] 結(jié)果見表4,表明本發(fā)明具有很好的特異性，可明確區(qū)分所有的受試樣本。
[0027]表4多重?zé)晒舛縋CR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例3 稱取相同重量的純牛肉和純豬肉樣本，用實(shí)施例1方法提取DNA，按照10倍系列稀釋，制 備DNA含量分別為500叫、50叫、51^、0.51^、0.05叫和0.005即（與肉類含量50%、5%、0.5%、 0.05%、0.005%和0.0005%相當(dāng)）的靈敏度測(cè)試樣本，并按照實(shí)施例1進(jìn)行試驗(yàn)。
[0028]結(jié)果見表5，可見本發(fā)明具有較高的靈敏度，可檢測(cè)DNA低至0.05ng的牛源性成分 和0.05ng的豬源性成分，相當(dāng)于可檢測(cè)含量約0.005%對(duì)應(yīng)動(dòng)物成分。
[0029] 表5多重?zé)晒舛縋CR靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例4 采用本發(fā)明檢測(cè)市售鮮禽畜肉及火腿腸、肉丸等加工產(chǎn)品30份，并與《SN/T 2051-2008 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:二者檢 測(cè)情況完全一致，并發(fā)現(xiàn)5份陽(yáng)性結(jié)果與商品的標(biāo)識(shí)不符合，詳見表6。
[0030] 表6多重?zé)晒舛縋CR應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限 制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均 應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA多重巧光定量PCR的引物探針 組，包括牛源性成分特異性引物和探針，豬源性成分特異性引物和探針，其中引物和探針W 及序列為： 牛源性成分的上游引物N-F 5'-ttgaattaggccatgaagca-3' ； 牛源性成分的下游引物N-R 5'-cgacttgtctcctctcatgtagc-3' ； 牛源性成分的探針T1 5'- FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQl-3'； 豬源性成分的上游引物Z-F 5'-aaccccgatagaccttaccaa-3' ； 豬源性成分的下游引物Z-R 5'-tcctttttagggtttgctgaag-3' ； 豬源性成分的探針T2 5'- Rox-tgccaattcagcctatataCCgcca-BHQ2-3'； 其中探針中的乂 "為L(zhǎng)NA修飾堿基，F(xiàn)AM和ROX為巧光基團(tuán)，BHQ1和BHQ2為巧滅基團(tuán)。2. 同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的Taqman-LNA多重巧光定量PCR的檢測(cè)試劑 盒，包括如下成分：3. 同時(shí)檢測(cè)肉或肉制品中牛、豬源性成分的化qman-LNA多重巧光定量PCR的方法，包括 W下步驟： (1) 待檢樣品DNA的提取， 將樣品與水按照1:4的比例(M/V)進(jìn)行勻漿，取制備的懸濁液50化，采用試劑盒法提取 DNA，但將DNA的定容體積改為1 試劑盒可選用Wizard Genomic DNA purification kit、核酸提取試劑盒、動(dòng)物組織基 因組DNA提取試劑盒等DNA提取試劑盒； (2) 多重巧光定量PCR，，巧光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的59°邱介段結(jié)束后收集FAM和ROX的巧光信號(hào);其反應(yīng)體系如下所示：(3)結(jié)果判斷:根據(jù)FAM和ROX兩個(gè)通道下的循環(huán)闊值，該值為Ct值進(jìn)行判斷，其中FAM通 道下是牛源性成分的檢測(cè)，R0X通道下是豬源性成分的檢測(cè)； 若陽(yáng)性對(duì)照Ct值《18，陰性對(duì)照無(wú) Ct值或Ct>30，則試驗(yàn)有效；當(dāng)樣品Ct值《25時(shí)判 為陽(yáng)性，即樣品中含有牛源性成分一FAM通道和/或豬源性成分一R0X通道;當(dāng)樣品Ct值>30 或無(wú) Ct值時(shí)判為陰性，即樣品中不含有牛源性成分一FAM通道和/或豬源性成分一R0X通 道;當(dāng)25<樣本Ct值<30時(shí)須復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果與原結(jié)果一致的判為弱陽(yáng)性，提示樣品中含有 微量，即被污染的牛源性成分一 FAM通道和/或豬源性成分一 R0X通道。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105969839SQ201510212723
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年4月29日
【發(fā)明人】吳圖揚(yáng), 許如蘇, 段建發(fā), 林宏, 梁希揚(yáng), 徐寧, 張楊, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名
【申請(qǐng)人】汕頭市檢測(cè)檢驗(yàn)學(xué)會(huì), 中華人民共和國(guó)汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局