酸催化乙醇/水預(yù)處理作為第二步預(yù)處理，考察預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間和乙醇 在預(yù)處理液中的體積比對(duì)竹材固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率的影 響，結(jié)果如表3所示。從中可以看出，當(dāng)乙醇在預(yù)處理液中的體積比為50%，預(yù)處理溫度從 140°C升高到180°C時(shí)，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率從47. 15%提高到72. 12% ;但葡 萄糖回收率則在預(yù)處理溫度為160°C時(shí)取得最大值（61. 30%)，這主要是由于高溫促使部分 纖維素發(fā)生水解而溶于預(yù)處理液。
[0059] 當(dāng)固定第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理的預(yù)處理溫度為160°C、乙醇在預(yù)處理液 中的體積比為50%，預(yù)處理時(shí)間從40min增加到80min時(shí)，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn) 化率從60. 25%提高到70. 34% ;繼續(xù)延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間到lOOmin，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水 解轉(zhuǎn)化率基本不變，但葡萄糖回收率則從64. 24%降低到62. 95%。由此可見(jiàn)，當(dāng)乙醇在預(yù)處 理液中的體積比為50%時(shí)，第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理較優(yōu)的預(yù)處理溫度和時(shí)間分別 為 160°C 和 80min。
[0060] 表3第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)竹材固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn) 化率和葡萄糖回收率的影響
Id-少兀阪惟億乙0字/ 7」、觀處埋的觀處埋M皮和H、」丨日」力、別刀比UU和8uminH、」，進(jìn)一 步優(yōu)化乙醇在預(yù)處理液中的體積比，結(jié)果如表3所示。當(dāng)乙醇在預(yù)處理液中的體積比從20% 增加到70%時(shí)，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率不斷增加，但葡萄糖回收率則呈現(xiàn)先 上升后下降的變化趨勢(shì)，最大葡萄糖回收率為65. 88%，此時(shí)乙醇在預(yù)處理液中的體積比為 60% 〇
[0061] 4、半纖維素酶添加量對(duì)第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理所得竹材固體基質(zhì)中纖 維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率的影響 盡管第一步預(yù)處理可使大部分半纖維素溶于預(yù)處理液中，但第二步預(yù)處理對(duì)半纖維素 產(chǎn)生的影響較小，最終所得固體基質(zhì)中仍然殘留一定量半纖維素。為減少半纖維素對(duì)固體 基質(zhì)中纖維素高濃酶水解的影響，在此考察半纖維素酶添加量對(duì)纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率 和葡萄糖回收率的影響，結(jié)果如表4所示。
[0062] 從表4中可以看出，當(dāng)半纖維素酶添加量從0. 5mg/g絕干固體基質(zhì)增加到2.Omg/ g絕干固體基質(zhì)時(shí)，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率從70. 28%增加到75. 32% ;繼續(xù)增 加半纖維素酶添加量到2. 5mg/g絕干固體基質(zhì)時(shí)，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和 葡萄糖回收率增加的幅度較小。因此，基于絕干固體基質(zhì)質(zhì)量，較優(yōu)化的半纖維素酶添加量 2. 0mg/g〇
[0063] 表4半纖維素酶添加量對(duì)第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理所得竹材固體基質(zhì)中纖 維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率的影響
5、超聲處理對(duì)第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理所得竹材固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水 解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率的影響 盡管耦合第一步無(wú)酸催化高沸點(diǎn)醇預(yù)處理和第二步無(wú)酸催化醇/水預(yù)處理可是大部 分半纖維素和木素溶于預(yù)處理液，但少量木素和半纖維素碎片仍然殘留于固體基質(zhì)內(nèi)部孔 洞和細(xì)胞腔中，其可覆蓋在固體基質(zhì)中的纖維素上，降低纖維素對(duì)酶的可及性，最終使得固 體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率無(wú)法顯著提高。
[0064] 表5超聲處理對(duì)第二步無(wú)酸催化乙醇/水預(yù)處理所得竹材固體基質(zhì)中纖維素高濃 酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率的影響
當(dāng)設(shè)定超聲處理時(shí)間為45min，超聲功率從100W增加到500W的過(guò)程中，固體基質(zhì)中纖 維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率從72. 43%增加到82. 34% ;繼續(xù)提高超聲功率到700W時(shí)，固體基質(zhì) 中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率基本不變。因此，固定超聲功率為500W，超聲處理時(shí)間從15min 增加到60min的過(guò)程中，從表5中可以看出，固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先 升高后趨于不變的趨勢(shì)。因超聲處理不會(huì)使纖維素發(fā)生降解，葡萄糖回收率與固體基質(zhì)中 纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)線性關(guān)系。綜合可知，較優(yōu)化的超聲處理功率和時(shí)間分別為 500W和45min，此時(shí)固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率分別高達(dá)82. 34% 和 75. 38%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法，包括如下步驟： (1) 選取2~3年生竹材，經(jīng)削片成竹片，將其作為原料進(jìn)行后續(xù)預(yù)處理； (2) 第一步高沸點(diǎn)醇預(yù)處理，其技術(shù)條件為：將步驟（1)制得的竹片原料放入密封后可 耐高壓的不銹鋼小罐內(nèi)，再往小罐的罐體中加入預(yù)處理所需的溶液，將小罐密封后置于油 浴反應(yīng)器中的固定支架上，蓋上油浴反應(yīng)器的蓋子后進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理溫度200~210°C， 預(yù)處理時(shí)間35~45min，上述預(yù)處理所需的溶液為高沸點(diǎn)醇預(yù)處理液，所述高沸點(diǎn)醇預(yù)處理 液由高沸點(diǎn)醇和去離子水組成，其中高沸點(diǎn)醇在高沸點(diǎn)醇預(yù)處理液中的體積比以ml: ml計(jì) 為大于8%小于等于15% ;高沸點(diǎn)醇預(yù)處理液和竹片原料質(zhì)量的比值以ml: g計(jì)為5~7，油浴 反應(yīng)器支架的轉(zhuǎn)動(dòng)速度為3~5rpm，預(yù)處理完成后，立即將油浴反應(yīng)器中的小罐取出，用自來(lái) 水冷卻至室溫，然后將小罐內(nèi)的固液混合物在60目的尼龍網(wǎng)袋中過(guò)濾，固體和液體分離后 得預(yù)處理液和固體基質(zhì)； (3) 固體基質(zhì)的分散處理，其技術(shù)條件為：將步驟（2)所得的固體基質(zhì)在植物粉碎機(jī)中 進(jìn)行處理，以降低固體基質(zhì)中纖維束的尺寸，每次取步驟（2)獲得的固體基質(zhì)20g，裝入搗 碎罐中，在8000~12000 r/min的剪切攪拌速度下處理20~30s，處理完成后，獲得較分散的、 纖維狀的固體基質(zhì)； (4) 第二步醇/水預(yù)處理，將步驟（3)制得的含纖維狀的固體基質(zhì)再次裝入密封后可耐 高壓的不銹鋼小罐內(nèi)，再往小罐的罐體中加入預(yù)處理所需的溶液，將小罐密封后置于油浴 反應(yīng)器中進(jìn)行預(yù)處理，其技術(shù)條件為：預(yù)處理溫度160~170°C，預(yù)處理時(shí)間60~90min，醇/水 預(yù)處理液由高沸點(diǎn)或低沸點(diǎn)醇和去離子水組成，其中高沸點(diǎn)或低沸點(diǎn)醇在醇/水預(yù)處理液 中的體積比以ml: ml計(jì)為大于等于50%小于等于70%，醇/水預(yù)處理液和固體基質(zhì)絕干質(zhì) 量的比值以ml: g計(jì)為8~15,預(yù)處理完成后，立即將油浴反應(yīng)器中的小罐取出，用自來(lái)水冷 卻，然后將小罐內(nèi)的固液混合物在墊有雙層濾紙的布氏漏斗上過(guò)濾，將固體和液體分離，得 經(jīng)第二步預(yù)處理的固體基質(zhì)； (5) 第二步無(wú)酸催化醇/水預(yù)處理所得固體基質(zhì)的超聲處理，其技術(shù)條件為：將步驟 (4)預(yù)處理后獲得的固體基質(zhì)裝入帶有鉆孔橡皮塞的三角瓶，往三角瓶中加入新鮮的醇/ 水混合溶液，其中醇在新配置的醇/水預(yù)處理液中的體積比以ml: ml計(jì)為大于等于50%小 于等于70%，新配置的醇/水預(yù)處理液和絕干固體基質(zhì)質(zhì)量的比值以ml: g計(jì)為8~15,再將 此三角瓶放入一個(gè)大燒杯中，往燒杯內(nèi)和血清瓶外的區(qū)域加入冰水混合物，然后將超聲探 頭通過(guò)鉆孔橡皮塞放入到三角瓶中的液體液面2/3以下的位置處，開(kāi)始進(jìn)行超聲處理，其 技術(shù)條件為：超聲處理的功率為500~700W，超聲處理時(shí)間30~60min，超聲處理完成后，立即 將三角瓶取出，然后在墊有雙層濾紙的布氏漏斗上過(guò)濾，將固體和液體分離，得經(jīng)超聲處理 的固體基質(zhì)； (6) 超聲處理所得固體基質(zhì)的洗滌，其技術(shù)條件為：將步驟（5)所得的固體基質(zhì)置于一 個(gè)大燒杯中，用去離子水對(duì)固體基質(zhì)進(jìn)行洗滌，所述去離子水與固體基質(zhì)以體積和質(zhì)量的 比值ml: g計(jì)為6~10,磁力攪拌速度為300~600r/min，洗滌時(shí)間為30~60min，洗滌溫度為 室溫，重復(fù)洗滌1次后，在墊有雙層濾紙的布氏漏斗上將固體基質(zhì)和洗滌液進(jìn)行分離，得經(jīng) 洗滌處理的固體基質(zhì)； (7) 洗滌后固體基質(zhì)的高濃酶水解，其技術(shù)條件為：將步驟（6)制得的固體基質(zhì)加入 到水熱釜的聚四氟乙烯內(nèi)襯中，將此內(nèi)襯裝入水熱釜內(nèi)，擰緊水熱釜的蓋子，然后將密封的 水熱釜安裝到空氣浴均質(zhì)反應(yīng)器的支架上，關(guān)上均質(zhì)反應(yīng)器的門(mén)后開(kāi)始進(jìn)行固體基質(zhì)的高 濃酶水解，其技術(shù)條件為：固體基質(zhì)作為底物的質(zhì)量比濃度為18%~25%，所述％指質(zhì)量百分 比，g: g，空氣浴均質(zhì)反應(yīng)器的空氣溫度為55~60°C，支架轉(zhuǎn)動(dòng)速度為200~250r/min，酶采 用纖維素酶、纖維二糖酶和半纖維素酶，所述纖維素酶、纖維二糖酶和半纖維素酶用量分別 為15~20FPU/g、22. 5~30CBU/g和0. 5~2. 5mg蛋白質(zhì)/g絕干纖維素，所述的纖維素含量是 指固體基質(zhì)中純纖維素的絕干質(zhì)量百分比，所采用的緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，緩沖 液的濃度和pH值分別為45~50mmol/L和4. 5~5. 0,酶水解時(shí)間為72~96h，酶水解結(jié)束后，立 即將水熱釜從均質(zhì)反應(yīng)器中取出，然后用200ml、0. lmol/L的NaHOV^液將水熱釜聚四氟 乙烯內(nèi)襯中固液混合物洗滌到一個(gè)500ml燒杯中，待固液分層后，取上層清液2ml，然后將 此清液迅速置于沸水浴中對(duì)纖維素酶、纖維二糖酶和半纖維素酶進(jìn)行滅活處理，處理時(shí)間 為15min，然后將樣品冷卻至室溫，測(cè)定其葡萄糖濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法，其特征 在于：步驟（2)所述的第一步高沸點(diǎn)醇預(yù)處理過(guò)程中高沸點(diǎn)醇在高沸點(diǎn)醇預(yù)處理液中的體 積比為8%~15%，即大于8%小于等于15%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法，其 特征在于：所述的醇為高沸點(diǎn)醇或低沸點(diǎn)醇，高沸點(diǎn)醇為25°C、1個(gè)大氣壓下沸點(diǎn)為210°C 以上的醇，低沸點(diǎn)醇為25°C、1個(gè)大氣壓下沸點(diǎn)為100°C以下的醇。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法，其特 征在于：所述的高沸點(diǎn)醇至少有一種選用1，4-丁二醇、丙三醇、1，3-丙二醇、1，4-戊二醇、 1，3-戊二醇或1，5-戊二醇。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法，其特征 在于：所述低沸點(diǎn)醇至少有一種選用甲醇、乙醇或正丙醇。6. 權(quán)利要求1-5任一所述的預(yù)處理方法用于處理竹材纖維原料來(lái)提高其纖維素高濃 酶水解的轉(zhuǎn)化率和經(jīng)酶水解獲得可發(fā)酵葡萄糖的回收率。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了<b>一種提高竹材纖維素高濃酶水解產(chǎn)可發(fā)酵糖效率的方法</b>，其步驟為：原料切削和篩選；第一步無(wú)酸催化的高沸點(diǎn)醇預(yù)處理；第一步預(yù)處理所得固體基質(zhì)的分散處理；第二步無(wú)酸催化醇/水預(yù)處理；第二步無(wú)酸催化醇/水預(yù)處理所得固體基質(zhì)的超聲處理；超聲處理所得固體基質(zhì)的洗滌；洗滌后固體基質(zhì)的高濃酶水解。本發(fā)明耦合兩步預(yù)處理和超聲處理可高效移除竹材原料中的半纖維素和木素，同時(shí)確保纖維素降解率處在較低水平。當(dāng)固體基質(zhì)作為酶水解底物的質(zhì)量濃度為20%時(shí)，進(jìn)一步添加半纖維素酶后，竹材固體基質(zhì)中纖維素高濃酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖回收率分別高達(dá)82.34%和75.38%?？杀苊鈴U液中半纖維素糖的降解和木素的縮合。
【IPC分類(lèi)】C12P19/14, C12P19/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105063132
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510534293
【發(fā)明人】羅小林, 劉婧, 李蒙, 黃六蓮, 陳禮輝
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月27日