一種利用發(fā)酵液分割法提高發(fā)酵罐使用效率的糖化酶發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用發(fā)酵液分割法提高發(fā)酵罐使用效率的糖化酶發(fā)酵工藝，屬于 酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖化酶能從淀粉鏈的非還原性末端切開(kāi)a -1，4葡萄糖苷鍵，是淀粉制糖工藝中 最重要的酶制劑，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、紡織等工業(yè)，是世界上生產(chǎn)量最大應(yīng)用范 圍最廣的酶制劑產(chǎn)品之一。由于淀粉分子在低溫下形成結(jié)構(gòu)緊密的晶體而高溫下又容易糊 化，因此實(shí)際生產(chǎn)中，往往利用淀粉酶將淀粉分解為相對(duì)分子量較小的糊精再進(jìn)一步用糖 化酶將糊精徹底分解為葡萄糖。在現(xiàn)代制糖工業(yè)中，黑曲霉糖化酶與細(xì)菌a -淀粉酶和普 魯蘭酶配合使用可以使淀粉幾乎全部水解得到葡萄糖含量在97%以上的葡萄糖糖漿，經(jīng)結(jié) 晶可以達(dá)到醫(yī)用葡萄糖的要求。黑曲霉糖化酶的最適pH為4. 5,在50~60°C可以長(zhǎng)時(shí)間保 持高水解活力，這一條件既能夠避免糖化反應(yīng)過(guò)程雜菌的污染又能避免葡萄糖與蛋白質(zhì)等 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有利于得到純凈的葡萄糖。上述特點(diǎn)使黑曲霉來(lái)源的糖化酶在淀粉制糖工 業(yè)中具有不可替代的作用。除制糖外，糖化酶還在釀酒、發(fā)酵等多個(gè)行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。
[0003] 糖化酶的生產(chǎn)菌種黑曲霉是一種絲狀真菌，發(fā)酵時(shí)其種子的制作需要從孢子開(kāi) 始，而黑曲霉生產(chǎn)菌經(jīng)過(guò)多年的誘變育種其孢子形成和萌發(fā)的能力均已嚴(yán)重退化，同時(shí)其 發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)速度也較慢，因此糖化酶的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，一般從制種到放罐的整個(gè)過(guò) 程耗時(shí)在28天以上，發(fā)酵時(shí)間一般在5天以上。
[0004] 在前期工作中，采用DNA重組的方法，對(duì)一株黑曲霉生產(chǎn)菌CICHMF0410進(jìn)行改 造，獲得了一批糖化酶基因拷貝數(shù)提高的菌株。其中編號(hào)為GB0506的菌株在搖瓶發(fā)酵條 件下糖化酶發(fā)酵酶活比出發(fā)菌CICHMF0410提高約17. 5%。（發(fā)表論文：姚婷婷等.攜多 拷貝glaA的重組黑曲霉過(guò)量合成糖化酶的研究.生物工程學(xué)報(bào)，2006年7月，22(4): 567-571)。在發(fā)酵罐發(fā)酵條件下，GB0506發(fā)酵水平也有所提高。與出發(fā)菌黑曲霉CICHM F0410相比，黑曲霉GB0506在發(fā)酵罐發(fā)酵條件下發(fā)酵過(guò)程雖然沒(méi)有延長(zhǎng)但其前期用于菌體 生長(zhǎng)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)階段占用發(fā)酵罐時(shí)間很長(zhǎng)，一般在發(fā)酵進(jìn)行到第四天時(shí)其 發(fā)酵液酶活依然在5000U/mL以下，這一特點(diǎn)使該菌株在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵時(shí)間不能縮短，生 產(chǎn)周期長(zhǎng)并缺乏靈活性。與此相比，由于黑曲霉CICHMF0410在發(fā)酵到第5天時(shí)發(fā)酵酶活 一般已經(jīng)與最高酶活接近，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，在生產(chǎn)任務(wù)緊張時(shí)可以提前放罐。上述原因 導(dǎo)致黑曲霉GB0506雖然發(fā)酵酶活比黑曲霉CICHMF0410有所提高，但在實(shí)際生產(chǎn)中未能得 到廣泛的應(yīng)用。
[0005] 針對(duì)黑曲霉GB0506的特點(diǎn)，本發(fā)明主要利用發(fā)酵中后期發(fā)酵液分割的方法，對(duì)分 割時(shí)機(jī)和分割方式進(jìn)行優(yōu)化，獲得了一種可以延長(zhǎng)黑曲霉GB0506發(fā)酵過(guò)程中糖化酶快速 線(xiàn)性增長(zhǎng)階段的方法。該方法可以大幅度提高發(fā)酵罐利用效率，縮短平均發(fā)酵周期，達(dá)到既 提高產(chǎn)量又實(shí)現(xiàn)節(jié)能的目標(biāo)，創(chuàng)造了一種適合于黑曲霉GB0506的發(fā)酵新工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是利用發(fā)酵液分割和發(fā)酵罐組合使用的方法提高黑曲霉GB0506糖 化酶發(fā)酵中發(fā)酵罐利用效率，降低發(fā)酵過(guò)程電能消耗。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一種利用發(fā)酵液分割法提高發(fā)酵罐使用效率的糖化酶發(fā)酵工 藝，針對(duì)糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉GB0506發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)并存在一個(gè)特殊的酶活快 速增長(zhǎng)期的特點(diǎn)建立的，步驟為：在黑曲霉GB0506糖化酶發(fā)酵酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)末期：即在采 用酶活為1200 -1400 U/mL的種子培養(yǎng)液按10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下，當(dāng)發(fā) 酵進(jìn)行到118-120小時(shí)的時(shí)候；將發(fā)酵液平均分配到3個(gè)發(fā)酵罐中，添加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基繼 續(xù)發(fā)酵40-42小時(shí)至發(fā)酵終點(diǎn)。
[0008] 所述利用發(fā)酵液分割法提高發(fā)酵罐使用效率的糖化酶發(fā)酵工藝，其特征在于：所 述斜面培養(yǎng)基為經(jīng)改良的查氏培養(yǎng)基，即在查氏培養(yǎng)基中添加0. 2%酵母粉與1%玉米淀粉， pH 5. 8 ； 查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵 〇? 〇lg，鹿糖 30g，瓊脂 20g，蒸餾水 1L，121°C滅菌 15 min ; 種子培養(yǎng)基：玉米淀粉8%，豆餅粉2%，硫酸銨0. 5%，氯化鈣0. 01%，用自來(lái)水配制，滅菌 前用中溫淀粉酶液化培養(yǎng)基；一級(jí)和二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)基，種子罐種子培養(yǎng)基均采用上述 種子培養(yǎng)基； 發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉18%，豆餅粉2. 8 %，玉米漿1. 5%，硫酸銨0. 5%，氯化鈣 0. 01%，用自來(lái)水配制，滅菌前用中溫淀粉酶液化培養(yǎng)基；發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程用氨水維持pH 4. 5-5. 0 ;補(bǔ)料時(shí)使用的發(fā)酵培養(yǎng)基與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同。
[0009] 將發(fā)酵液分配到幾個(gè)未使用的發(fā)酵罐中，添加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵。與原有 工藝相比，采用這一方法獲得的發(fā)酵液最高酶活沒(méi)有變化，但每一個(gè)發(fā)酵罐的平均使用時(shí) 間大幅度下降，極大節(jié)約了發(fā)酵過(guò)程的電能消耗并提高了生產(chǎn)強(qiáng)度。其具體工藝為： (1)發(fā)酵液分割工藝： 首先按糖化酶發(fā)酵的傳統(tǒng)方法，當(dāng)種子罐種子培養(yǎng)液酶活達(dá)到1200U/mL以上時(shí)按10% 接種量接種至發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基。按照傳統(tǒng)批式發(fā)酵法工藝，接種發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基后一 般在第五天酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)結(jié)束，再發(fā)酵約24小時(shí)，即發(fā)酵進(jìn)行至第六天時(shí)酶活達(dá)到最高水 平，隨后結(jié)束發(fā)酵。使用這一工藝時(shí)發(fā)酵罐一共使用了六天，144小時(shí)。
[0010] 本發(fā)明在第五天（即118-120小時(shí)的時(shí)候）酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)剛結(jié)束時(shí)，將發(fā)酵液分割 為3罐，再補(bǔ)充新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基后繼續(xù)發(fā)酵，在這一條件下，由于補(bǔ)充了新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基， 所以發(fā)酵液分割后酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)可以再維持一段時(shí)間。其中將發(fā)酵液分割為三罐的條件下 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)一分三工藝)，酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)可以再維持約24小時(shí)，分割后維持發(fā)酵40-42小時(shí) 酶活達(dá)到最高水平。這時(shí)結(jié)束發(fā)酵一共可以得到三罐發(fā)酵液。在這一新工藝條件下，第一 個(gè)發(fā)酵罐的使用時(shí)間為162小時(shí)，后補(bǔ)充的兩個(gè)發(fā)酵罐的使用時(shí)間僅為40-42小時(shí)，以發(fā)酵 液分割后再發(fā)酵42小時(shí)計(jì)算，三個(gè)發(fā)酵罐平均單罐使用時(shí)間為82小時(shí)。
[0011] 如果采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，將三個(gè)發(fā)酵罐分別接種種子培養(yǎng)基，則三個(gè)發(fā)酵罐均需 要發(fā)酵144小時(shí)。采用新工藝后，在獲得同樣體積和發(fā)酵酶活的發(fā)酵液的前提下，平均單罐 發(fā)酵時(shí)間縮短了 62小時(shí)以上，即43%。同時(shí)，由于糖化酶發(fā)酵過(guò)程需要高強(qiáng)度的通風(fēng)和攪 拌，采用一分三工藝可以大幅度節(jié)省發(fā)酵過(guò)程中攪拌、通風(fēng)等能量消耗。
[0012] (2) -分三工藝條件下的發(fā)酵罐組合使用方法 在前面介紹的發(fā)酵液分割工藝中，在發(fā)酵前期（酶活線(xiàn)性增長(zhǎng)末端之前，即發(fā)酵前五天 或從發(fā)酵開(kāi)始到118-120小時(shí)的時(shí)候)只使用一個(gè)發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體和發(fā)酵，另外兩個(gè)發(fā)酵罐 在近5天時(shí)間里處于等待狀態(tài)，這顯然不利于設(shè)備的充分利用，針對(duì)這一問(wèn)題本發(fā)明建立 了一套發(fā)酵罐組合使用的方法，組合使用5個(gè)發(fā)酵罐提高發(fā)酵罐使用效率。具體方法如下： 在黑曲霉GB0506糖化酶發(fā)酵中，組合使用5個(gè)編號(hào)分別為A、B、C、D、E的發(fā)酵罐，按每 周一個(gè)循環(huán)進(jìn)行發(fā)酵。其中A、B、C三個(gè)發(fā)酵罐輪流作為第一罐發(fā)酵（以下稱(chēng)一級(jí)發(fā)酵)，按 48小時(shí)一罐間隔接入種子培養(yǎng)