一種高速逆流色譜分離制備高純度石杉?jí)A丙的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用高速逆流色譜法分離純化石杉 堿丙的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer)是一組原因未明的原發(fā)性腦變性疾病，常起病于老年 或老年前期，多緩慢發(fā)病，并逐漸進(jìn)展，最終以癡呆為主要表現(xiàn)。隨著我國(guó)人均期望壽命的 提高和老齡化社會(huì)的步步逼近，阿爾茨海默病開(kāi)始大面積地出現(xiàn)在我國(guó)老年人群中，對(duì)患 者及其家庭產(chǎn)生了嚴(yán)重危害。截至2012年底，我國(guó)60歲及以上老年人口已達(dá)1. 94億，占 總?cè)丝诘?4. 3%，預(yù)計(jì)2013年將突破2億，2034年突破4億。而據(jù)有關(guān)資料顯示，60歲以 上阿爾茨海默病的患者占老齡人口的6%，阿爾茨海默病已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。因 此，尋找和創(chuàng)制對(duì)阿爾茨海默病具有顯著療效的新型藥物意義重大。
[0003] 臨床實(shí)驗(yàn)早已證實(shí)石杉?jí)A甲（Huperzine A)治療阿爾茨海默病的療效顯著，但近 年來(lái)，由于提取石杉?jí)A甲高額利潤(rùn)的驅(qū)使，人們對(duì)蛇足石杉地毯式的采收使得該類(lèi)植物銳 減，除了尋找生產(chǎn)石杉?jí)A甲的新途徑外，充分利用蛇足石杉資源，挖掘與石杉?jí)A甲等效的石 松生物堿勢(shì)在必行。石杉?jí)A丙（Huperzine C)作為一種與石杉?jí)A甲結(jié)構(gòu)相近的Iycodine 型生物堿，其AchE活性抑制能力接近石杉?jí)A甲，但由于其含量較低、獲得難度較大而未得 到足夠的重視。
[0004] 高速逆流色譜（HSCCC)是基于流體動(dòng)力學(xué)平衡而發(fā)展起來(lái)的色譜技術(shù)。它的固定 相和流動(dòng)相由互不相溶的溶劑體系的上下相組成，依據(jù)特殊的離心力場(chǎng)將固定相保留在分 離柱內(nèi)，流動(dòng)相由液相栗帶動(dòng)，不斷穿過(guò)固定相完成高效、快速、多次、連續(xù)萃取。目前HSCCC 已在天然產(chǎn)物分離領(lǐng)域獲得了巨大成功。而現(xiàn)有文獻(xiàn)中未見(jiàn)有應(yīng)用高速逆流色譜分離純化 石杉?jí)A丙的報(bào)道。
[0005] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)分離純化石杉?jí)A丙單體 化合物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、高制備量地分離制備高純度石杉?jí)A丙的方法，所 述方法高效快速，操作簡(jiǎn)便。
[0007] 本發(fā)明的分離制備方法是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種高速逆流色譜分離制備高純度石杉?jí)A丙的方法，包括如下步驟：
[0009] A、分離的兩相溶劑系統(tǒng)由正己燒、乙酸乙酯、甲醇和水3~5:6:3~5:6混勾后分 層得到；
[0010] B、將兩相溶劑體系的上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相；
[0011] C、將固定相栗入至逆流色譜柱內(nèi)，然后開(kāi)動(dòng)主機(jī)，并按設(shè)定轉(zhuǎn)速開(kāi)啟旋轉(zhuǎn)，再向柱 內(nèi)栗入流動(dòng)相；待兩相溶劑體系在逆流柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；
[0012] D、然后將包含石杉?jí)A丙的樣品溶于兩相溶劑體系的下相；通過(guò)進(jìn)樣閥將樣品溶液 注入至逆流柱內(nèi)；
[0013] E、收集高純度石杉?jí)A丙餾分。
[0014] 上述A步驟中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照體積比為2:3:2:3混合得到。
[0015] C步驟中栗入固定相時(shí)的流速為20-50mL/min，栗入流動(dòng)相時(shí)的流速為1.2~ 2. OmT,/mi n 〇
[0016] C步驟中高速逆流色譜的主機(jī)轉(zhuǎn)速為800~900rpm。
[0017] 優(yōu)選C步驟中栗入流動(dòng)相時(shí)的流速為I. 5mL/min ;高速逆流色譜的主機(jī)轉(zhuǎn)速為 900rpm〇
[0018] 上述方法的操作溫度為25~35 °C，優(yōu)選25 °C。
[0019] 上述方法使用紫外檢測(cè)器作為高速逆流色譜的檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254~365nm。 優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。
[0020] D步驟中所述的包含石杉?jí)A丙的樣品為蛇足石杉提取物。
[0021] D步驟中包含石杉?jí)A丙的樣品溶于兩相溶劑體系的下相中的濃度為10-40mg/mL。
[0022] 本發(fā)明所述方法使用的原料為中藥蛇足石杉提取物，系參考專(zhuān)利（【申請(qǐng)?zhí)枴?200410084633. 1)從蛇足石杉中提取得到的生物堿復(fù)合成分。
[0023] 本發(fā)明采用自動(dòng)餾分收集器接收餾分；分離完成后，采用高效液相色譜對(duì)收集的 餾分進(jìn)行純度檢測(cè)；合并純度較高的包含石杉?jí)A丙的餾分；隨后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去合并餾 分中的溶劑，得到石杉?jí)A丙固體；高效液相色譜分析測(cè)得最終分離得到的石杉?jí)A丙的純度 為 93%。
[0024] 本發(fā)明首次利用高速逆流色譜技術(shù)分離純化得到高純度的石杉?jí)A丙，該方法具有 操作簡(jiǎn)單、高效快速、制備量大及純度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種適于大量制備生產(chǎn)高純度石杉?jí)A丙 的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為實(shí)施例1分離石杉?jí)A丙的高速逆流色譜圖；
[0026] 圖2為實(shí)施例1分離得到的石杉?jí)A丙的高效液相色譜純度分析圖；
[0027] 圖3為對(duì)比例2分離石杉?jí)A丙的高速逆流色譜圖；
[0028] 圖4為對(duì)比例2分離得到的石杉?jí)A丙的高效液相色譜純度分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0030] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 實(shí)施例1 :
[0033] 高速逆流色譜法分離純化蛇足石杉粗提物中的石杉?jí)A丙。
[0034] 1.樣品的制備：使用中藥蛇足石杉提取物作為本實(shí)施例的樣品，該樣品是參考專(zhuān) 利（【申請(qǐng)?zhí)枴?00410084633. 1)從蛇足石杉中提取得到，是一生物堿復(fù)合物，包含石杉?jí)A丙 以及石杉?jí)A甲、石杉?jí)A乙等。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去粗提物的溶劑后，得到粗提物浸膏。
[0035] 2.兩相溶劑體系的制備：將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照2:3:2:3( V:V)的比 例充分混合均勻后，將上、下相分層，并分別使用超聲脫氣30min，除去溶劑中的氣泡。
[0036] 3.樣品溶液的配制：取步驟1中得到的浸膏200mg溶解于5mL兩相溶劑體系的下 相。
[0037] 4.儀器：本實(shí)施例使用的高速逆流色譜儀為上海同田生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 TBE-300B，純度分析中使用的高效液相色譜儀為美國(guó)戴安公司生產(chǎn)的Ultimate 3000。
[0038] 5.高速逆流色譜分離：將固定相以20mL/min的流速栗入到逆流色譜柱內(nèi)，待固定 相充滿(mǎn)逆流柱后開(kāi)動(dòng)主機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速900rpm，待轉(zhuǎn)速達(dá)到設(shè)定的轉(zhuǎn)速后，以I. 5mL/min的流 速向柱內(nèi)栗入流動(dòng)相；當(dāng)兩相溶劑體系在逆流柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥將5mL樣 品溶液注入至逆流柱內(nèi)；分離過(guò)程中使用紫外檢測(cè)器對(duì)餾分進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)定為254nm， 采用色譜工作站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集與處理，同時(shí)采用自動(dòng)餾分收集器接收餾分，4min每管； 所得到的高速逆流色譜圖如圖1所示，從圖中可以看出粗提物中成分較為復(fù)雜，而石杉?jí)A 丙與其他化合物有較好的分離度。
[0039] 6.純度分析：分離完成后，采用高效液相色譜對(duì)收集的餾分進(jìn)行純度檢測(cè)，以 石杉?jí)A丙的峰面積占總峰面積的百分比來(lái)考察分離得到的餾分純度；色譜分析的條件 為：色譜柱 Waters Spherisor0DS2(250mmX 4.6mm i.d.，5 y m)，柱溫 30°C，流動(dòng)相為乙 腈：0. 4%的醋酸水溶液體積比40:60,流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10